I. MỤC ĐÍCH

Mô tả quy trình kiểm tra, lưu giữ, bảo quản chủng chuẩn  cho nhân viên phòng nuôi cấy của khoa Vi sinh thực hiện.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

Quy trình này áp dụng cho các nhân viên phòng nuôi cấy, khoa Vi sinh, Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

   -  Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật, 2007. http://vietsciences.org  Dương Văn Hợp, Nguyễn Lân Dũng      

   -  CLSI M100-S22, năm 2012. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Second Informational Supplement, this document provides updated tables for the Clinical and Laboratory Standards Institute antimicrobial susceptibility testing standards.

IV. TRÁCH NHIỆM

Nhân viên xét nghiệm khoa vi sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh có trách nhiệm thực hiện theo đúng quy trình

Người thực hiện: cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên nghành vi sinh, làm việc tại khoa Vi sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh

V.ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

Giải thích thuật ngữ

-    Chủng (strain): là chủng vi khuẩn nuôi cấy thuần nhất, được lấy ra từ một khuẩn lạc duy nhất (không lẫn với một khuẩn lạc nào khác).

-    Chủng chuẩn (reference strain): là chủng mang tên loài và là chuẩn vĩnh viễn cho loài này. Một loài bao gồm chủng này và tất cả các chủng tương tự như nó.

Từ viết tắt

• SOP     =          Quy trình chuẩn (Standard of Procedure).
• ATCC =          American Type Culture Collection
• CLSI   =        Clinical and Laboratory Standards Institute
• SVHH =        Sinh vật hóa học
• KSĐ   =         Kháng sinh đồ

VI. NGUYÊN LÝ

Các chủng vi sinh vật nên được lưu giữ, bảo quản. Đặc biệt với các chủng vi sinh vật nhất là chủng chuẩn, các chủng vi sinh vật cần được duy trì đặc tính sinh học, tính trạng di truyền là rất quan trọng. Các phương pháp bảo quản không thích hợp có thể dẫn đến đột biến hoặc mất plasmid. Do vậy cần phải chọn các phương pháp bảo quản thích hợp cho các chủng chuẩn.

Chủng chuẩn được lưu giữ, bảo quản đúng giúp cho chủng sống, có quy trình cấy chuyển hợp lý đảm bảo luôn có chủng mới phục vụ cho công việc kiểm tra chất lượng thường xuyên, giảm khả năng biến đổi kiểu hình, kiểu gen của chủng cũng như giảm khả năng tạp nhiễm các vi khuẩn khác.

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

Thiết bị

• Tủ an toàn sinh học;
• Kính hiển vi;
• Tủ ấm;
• Tủ lạnh, tủ âm sâu (-80⁰ C).
• Máy Vitek Compact (Bio Merieux, Pháp)
• Máy đo độ đục

Dụng cụ

• Lam kính sạch;                    
•  Đèn cồn;
• Dầu soi;                                

-  Que cấy;

• Bút chì kính;                        

Hóa chất, thuốc thử

- Bộ thuốc nhuộm Gram:

+ Tím Gentian;

+ Iodine;

+ Cồn 96⁰_;

+ Safranine/ Fuchsin.

- Các môi trường nuôi cấy: thạch máu, thạch sô cô la, thạch thường...

- Bộ sinh vật hóa học: API 20E, API 20NE, API 20strep;

- Thạch Muller – Hinton, dải giấy kháng sinh ( E test);

- Card định danh và card kháng sinh đồ (đi kèm máy Vitek Compact)

- Các hóa chất khác: khoanh giấy optochin, huyết tương thỏ,...

VIII. NỘI DUNG

Kiểm tra, lưu trữ chủng

- Chủng chuẩn được đưa về cấy chuyển ra môi trường thích hợp (thạch máu với Streptococcus pneumoniae, thạch sô cô la với Haemophilus influenzae, thạch thường với những chủng dễ mọc), nuôi cấy qua đêm ở 37⁰ C, có hoặc không có CO₂ với yêu cầu từng chủng;

  - Khi chủng mọc, kiểm tra tính thuần nhất của khuẩn lạc, nhuộm Gram để xác định hình thể và làm các thử nghiệm sinh vật hóa học để định danh lại chủng hoặc định danh bằng máy Vitek Compact theo quy trình VS.QTKTNC.22. Làm kháng sinh đồ theo hướng dẫn của CLSI với từng chủng;

- Dùng que cấy vô khuẩn lấy chủng và giữ trong môi trường giữ chủng thích hợp (glycerol 15% với những chủng dễ mọc, skim milk với những chủng khó mọc) để ở tủ -80⁰ C (chủng lưu trữ);

- Ghi chép lại các tính chất của chủng vào lý lịch chủng

Cấy chuyển chủng

- Lấy chủng lưu trữ từ tủ âm ra, dùng ngay que cấy vô trùng lấy chủng (khi ống giữ chủng vẫn còn đông đá, trước khi rã đông) cấy vào môi trường thích hợp, để qua đêm ở 37⁰ C, có hoặc không có nồng độ CO₂ thích hợp với yêu cầu từng chủng;

- Khi chủng mọc, kiểm tra độ thuần khiết, xác định lại chủng (nếu cần), cấy chuyển chủng ở thạch thường nghiêng (đối với chủng dễ mọc) hoặc sô cô la nghiêng (đối với chủng khó mọc) và để qua đêm ở 37⁰ C, có hoặc không có nồng độ CO₂ thích hợp với yêu cầu từng chủng;

- Sau đó để ở 2 – 8⁰ C (chủng làm việc – working strain) và cấy chuyển hàng tuần. Chuẩn bị một chủng làm việc mới ít nhất 1 tháng 1 lần.

- Trước khi tiến hành các thử nghiệm, cấy chuyển chủng lên đĩa thạch để thu được khuẩn lạc riêng rẽ. Đối với chủng đã đông băng, cấy chuyển chủng 2 lần trước khi tiến hành thử nghiệm.

- Chủng chuẩn mới cấy chuyển được dùng để kiểm tra liên tục chất lượng khoanh giấy, dải giấy kháng sinh, chất lượng môi trường, hoạt động máy Vitek Compact, làm chứng trong các thử nghiệm thường quy…

IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

- Không áp dụng

X. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

Kiểm tra hàng ngày: tiến hành khi không quá 3 trong số 30 kết quả kiểm tra liên tục của chủng vi khuẩn với từng kháng sinh nằm ngoài khoảng cho phép của CLSI;

Kiểm tra hàng tuần: có thể chuyển từ kiểm tra hàng ngày sang hàng tuần khi chứng minh được:

   + Có số liệu kết quả kiểm tra của các chủng trong 20 hoặc 30 ngày liên tiếp;

   + Không quá 1 trong số 20 hoặc 3 trong số 30 kết quả này của chủng vi khuẩn với từng kháng sinh nằm ngoài khoảng cho phép của CLSI.

Kiểm tra bổ sung: tiến hành kiểm tra chất lượng mỗi lần 1 tuần hoặc khi có bất kỳ sự thay đổi một thành phần hóa chất nào đó. Nếu có bất kỳ một kết quả nào nào nằm ngoài khoảng cho phép, cần phải tìm hiểu nguyên nhân và kiểm tra lại các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả.

XI. AN TOÀN

- Những cán bộ tham gia lưu giữ chủng vi khuẩn có quyền truy cập vào nơi lưu giữ chủng chuẩn; 

- Phải trang bị bảo hộ cá nhân khi tiếp xúc với chủng và thực hiện đúng qui trình;

- Xử lý tất cả các chủng tránh lây nhiễm

XII. HỒ SƠ LƯU

XIII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN