I. MỤC ĐÍCH

Mô tả quy trình hướng dẫn kĩ thuật làm giá đường Api 20NE để định danh vi khuẩn cho nhân viên phòng nuôi cấy thực hiện.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

Quy trình này áp dụng cho các nhân viên phòng nuôi cấy, khoa Vi sinh, Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• REF 20 050 07615H - GB - 2003/10 (http://www.biomerieux.com)

IV. TRÁCH NHIỆM

Nhân viên xét nghiệm khoa vi sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh có trách nhiệm thực hiện theo đúng quy trình

Người thực hiện: cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên nghành vi sinh, làm việc tại khoa Vi sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh

V.ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

Giải thích thuật ngữ

• Không áp dụng

Từ viết tắt

• SOP     =          Quy trình chuẩn (Standard of Procedure)
• KXN   =          Khoa Xét nghiệm
• ATSH =          An toàn sinh học
• NE       =          Non - Enterobacteriaceae
• MAC   =          Maconkey

VI. NGUYÊN LÝ

Thanh Api 20NE gồm có 20 giếng nhỏ có chất nền (8 test thông thường và 12 test đồng hóa), khi cho canh khuẩn vào và ủ ở 30⁰ C trong 18 – 24 h, sự trao đổi chất trong quá trình ủ sẽ trực tiếp làm đổi màu môi trường, hay khi cho thêm hóa chất thích hợp đối với các test thông thường hoặc làm đục môi trường đối với các test đồng hóa mà mắt thường nhìn thấy được. Kết quả của các phản ứng này được đọc bằng phần mềm hoặc sách hướng dẫn của hãng Bio Merieux. Từ các kết quả đó ta có các xác xuất của vi khuẩn nào đó (theo nghiên cứu của nhà sản xuất đã được công nhận.

 

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

Thiết bị

• Tủ an toàn sinh học
• Tủ ấm 30⁰ C
• Máy vi tính và phân mềm đọc giá đường Api (Api web) hoặc sách “API 20 NE Analytical Profile Index”.
• Máy đo độ đục Vitek 

Dụng cụ

• Pipet nhựa vô khuẩn 1ml
• Ống thủy tinh vô khuẩn 5ml
• Đèn cồn, que cấy
• Lam kính, giấy thấm
• Hộp nhựa để ủ giá đường

• Bảo hộ lao động: Găng tay, khẩu trang, mũ giấy….

Hóa chất, thuốc thử

• Thanh Api 20NE
• Nước muối sinh lý (NaCl 0.85%) hoặc Api Suspension medium 5ml
• Ống Api AUX medium 7ml
• JAMES
• NIT1 + NIT2
• Oxidase
• Parafin

VIII. NỘI DUNG

Bệnh phẩm

• Chủng vi khuẩn là các cầu trực khuẩn Gram âm hoặc trực khuẩn Gram âm dễ mọc không phải họ đường ruột (ví dụ: Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium, Moraxella, Vibrio, Aeromonas .... )
• Chủng thuần, được nuôi cấy qua đêm (18 – 24 giờ)

Các bước tiến hành

• Làm test oxydase: ghi kết lại kết quả và sẽ điền vào vị trí 21 của kết quả làm giá đường.
• Chỉ làm giá đường Api 20NE với các trực khuẩn Gram âm có test Oxydase dương tính (không phải họ đường ruột).
• Tuy nhiên cũng tiến hành làm giá đường Api 2 NE với vi khuẩn có test Oxydase âm tính (ví dụ Acinetobacter, S. maltophilia....) nhưng phải dựa vào tính chất vi khuẩn học và tiêu chuẩn lâm sàng.
• Các vi khuẩn khó mọc như Brucella và Francisella thì không sử dụng giá đường Api 20NE để định danh.
• Chuẩn bị cho thanh Api 20NE:

+ Lấy 1 hộp ủ nhựa (khay và nắp cung cấp kèm trong hộp Api) và cho khoảng 5ml nước cất hoặc nước sinh hoạt vào đầy các lỗ trên khay. Ghi lại các thông tin của mẫu cần chạy lên khay (số bệnh phẩm, ngày giờ thực hiện…);

+ Lấy thanh Api 20NE  ra khỏi vỏ;

+ Đặt thanh Api 20NE  vào trong hộp ủ.

• Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn:

+ Mở nắp ống nước muối sinh lý 5ml đã hấp vô trùng ( hoặc ống API Supspension medium 2ml);

+ Dùng que cấy lấy 2 – 3 khuẩn lạc đã nuôi cấy thuần nhất qua đêm (18h -24h) nghiền vào trong ống nước muối để tạo huyền dịch có độ đục 0,5 Mac Faland (so với độ đục chuẩn hoặc đo bằng máy).

• Tiến hành ủ:

+ Dùng pipet vô khuẩn hút canh khuẩn vừa pha nhỏ vào các giếng: nhỏ vừa đủ đến miệng giếng từ giếng NO3 đến PNPG

+ Mở nắp ống Api AUX medium 7ml, cho khoảng 10 giọt (200 µl) canh khuẩn vào trộn đều và nhỏ vào các giếng từ GLU tới PAC, chú ý phải nhỏ bằng mặt giếng hoặc có vồng (nhỏ quá ít hoặc bị tràn có thể làm sai kết quả)

+ Nhỏ paraphin vào đầy các giếng có gạch chân là GLU, ADH, URE

+ Đậy nắp khay của hộp ủ

+ Để vào tủ ấm 30⁰ C (29 ⁰C ± 2⁰ C) ủ trong vòng 24h

• Đọc kết quả: Sau giai đoạn ủ ta lấy giá đường ra và đọc kết quả âm tính hay dương tính của các giếng theo bảng phụ lục.

+ Giếng NO3 phải nhỏ thêm 1 giọt NIT1 và 1 giọt NIT2 và đợi 5 phút trước khi đọc kết quả, kết quả dương tính có màu đỏ

 + Giếng TRP phải nhỏ thêm 1 giọt JAMES và đợi 5 phút trước khi đọc kết quả, kết quả dương tính khi giếng chuyển sang màu hồng

+ Các test đồng hóa (các giếng từ GLU tới PAC) dương tính khi bề mặt bị đục.

IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

• Chấm điểm: Có 20 giếng được chia thành 7 nhóm, mỗi nhóm có 3 giếng (nhóm cuối cùng có hai giếng và kết quả oxydase test được tính là ô thứ 3):

Giếng đầu tiên dương tính được:      1 điểm                        âm tính: 0 điểm

Giếng thứ hai dương tính được:        2 điểm            âm tính : 0 điểm

Giếng thứ 3 dương tính được:           4 điểm                        âm tính : 0 điểm

• Xác định mã số: tính điểm tổng số điểm của các giếng trong cùng một nhóm ta có số điểm của nhóm đó. Theo thư tự, số điểm của các nhóm lập thành một mã số có 7 chữ số (có 7 nhóm).
• Xác định tên vi khuẩn: Dùng mã số vừa xác định được tra bằng sách “API 20 NE Analytical Profile Index”., hoặc bằng phần mềm do hãng cung cấp để có được tên vi khuẩn với xác suất nhất định.
• Trường hợp không định danh được (không có mã số hoặc mã số không cho kết quả) ta phải ủ thêm 24 giờ nữa rồi đọc lại kết quả (trừ các test GLU, NO3, TRP chỉ đọc 1 lần ở 24 giờ đầu).

X. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

• Không sử dụng hóa chất hết hạn
• Kiểm tra xem sự nguyên vẹn của hóa chất: có bị hở không? có vỡ không?...
• Không sử dụng các thanh đã bị hỏng: biến dạng, bị khô….
• Thực hiện đúng các theo qui trình và hướng dẫn của nhà cung cấp
• Cân nhắc trước khi trả kết quả: liên hệ với bệnh sử, nguồn gốc bệnh phẩm, tính thuần chủng, hình thái quan sát được dưới kính hiển vi; nếu cần thiết, thực hiện riêng biệt từng test .
• Các thao tác được thực hiện trong tủ ATSH và đảm bảo nguyên tắc vô trùng

XI. AN TOÀN

• Kít này có nguồn gốc từ động vật và đảm bảo không bị lây nhiễm các mầm bệnh. Tuy nhiên các sản phẩm này vẫn phải được xử lý như một nguồn lây nhiễm tiềm ẩn.
• Tất cả các bệnh phẩm nuôi cấy vi khuẩn và các sản phẩm liên quan phải được xử lý như là nguồn lây nhiễm.
• Kỹ thuật vô khuẩn và các biện pháp phòng ngừa cần được tuân thủ trong suốt quá trình tiến hành.

XII. HỒ SƠ LƯU

• Giá đường Api 20NE và Api 20NE reagent kit được bảo quản ở 2⁰ C – 8⁰ C và được lấy ra để ở nhiệt độ thường 10 phút trước khi sử dụng
• Canh khuẩn pha xong phải được sử dụng ngay
• Khi giá đường đã được ủ 24 giờ mà ta chưa đọc kết quả được ngay thì phải để vào ngăn mát của tủ lạnh (2⁰ C – 8⁰ C)
• Trường hợp mã số không cho kết quả thì ta phải làm lại và định danh bằng phương pháp khác nếu có thể (ví dụ: định danh bằng máy Vitek Compact)

XIII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

• Không áp dụng