I. MỤC ĐÍCH

Mô tả quy trình cho nhân viên phòng nuôi cấy về cách làm kháng sinh đồ theo phương pháp khoanh giấy khuếch tán Kirby – Bauer.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

Quy trình này áp dụng cho các nhân viên phòng nuôi cấy, khoa Vi sinh, Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• Diagnostic Microbiology – 4^thEdition – Washington, Philadelphia
• Bergey^’s Manual of  Determinative Bacteriology – 9^th Edition – William & Wilkins;
• Manual of Clinical Microbiology – 8^th Edition- Washington DC- Patrick R.Murray.
• Kỹ thuật xét nghiệm Vi sinh lâm sàng (Nhà xuất bản Y học, 2006)

IV. TRÁCH NHIỆM

Nhân viên xét nghiệm khoa vi sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh có trách nhiệm thực hiện theo đúng quy trình

Người thực hiện: cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên nghành vi sinh, làm việc tại khoa Vi sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh

V.ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

Giải thích thuật ngữ

• Không áp dụng

Từ viết tắt

• SOP     =          Quy trình chuẩn (Standard of Procedure)
• KXN   =          Khoa Xét nghiệm
• ATCC =          American Type Culture Collection
• ATSH =          An toàn sinh học
• BMH   =          Muller – Hinton máu
• CFU    =          Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc).
• ESBL  =          Expanded Spectrum Beta Lactam
• KSĐ    =          Kháng sinh đồ
• MH     =          Muller – Hinton thường

VI. NGUYÊN LÝ

Khoanh giấy có đường kính và độ dày nhất định, vô trùng, đã tẩm sẵn kháng sinh với nồng độ nhất định (dựa vào hiệu lực của từng kháng sinh) được đặt lên đĩa môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn. Sauk hi ủ ấm ở nhiệt độ và khí trường thích hợp, vi khuẩn chỉ mọc được ở nơi có nồng độ kháng sinh thấp hoặc không có. Tùy theo khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn mà tạo ra vùng ức chế xung quanh khoanh giấy kháng sinh, dựa vào đường kính vùng ức chế ta xác định được mức độ nhạy cảm của vi khuẩn được thử với kháng sinh

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

Thiết bị

• Tủ an toàn sinh học
• Tủ ấm Memmert 35⁰ C, 37⁰ C
• Tủ ấm CO₂
• Máy đo độ đục
• Máy ria kháng sinh đồ

Dụng cụ

• Đèn cồn
• Que cấy
• Ống thủy tinh vô trùng 5 ml
• Đĩa thủy tinh sạch và kim lấy máu để phân phối khoanh giấy kháng sinh

Hóa chất, thuốc thử

• Ống nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) đã được hấp tiệt trùng,
• Ống  Mac Farland  0,5 và 1,

- Đĩa thạch Muller-Hinton thường có đường kính 90 mm (cho vi khuẩn dễ mọc: vi khuẩn đường ruột, Acinetobacter, Pseudomonadaceae ...) và máu (cho vi khuẩn khó mọc: liên cầu, phế cầu, Listeria, Neisseria ...).

- Khoanh giấy kháng sinh.

VIII. NỘI DUNG

Bệnh phẩm

• Chủng thuần, được nuôi cấy qua đêm 18 – 24 h, hoặc tăng sinh 2 – 6 h

Kỹ thuật tiến hành

Pha huyền dịch vi khuẩn

• Phương pháp tăng sinh để pha huyền dịch vi khuẩn:

+ Trên mặt thạch phân lập, chọn ít nhất từ ba đến năm khuẩn lạc vi khuẩn giống nhau và tách rời. Dùng que cấy chạm vào đầu mỗi khuẩn lạc vi khuẩn rồi cấy chuyển vào 4 đến 5ml môi trường lỏng thích hợp như tryptic soy broth.

+ Ủ canh cấy lỏng này ở 37⁰ C cho đến khi đạt được hay hơn độ đục chuẩn MacFarland 0,5 (thường từ 2 đến 6 giờ). Huyền dịch vi khuẩn như vậy có chứa khoảng 1 - 2 x 10⁸ CFU/ml.

+ Dùng môi trường lỏng hay nước muối sinh lý vô khuẩn để điều chỉnh độ đục của canh cấy vi khuẩn đang tăng trưởng này đến độ đục chuẩn MacFarland 0,5 bằng máy đo độ đục.

• Pha huyền dịch vi khuẩn trực tiếp từ khuẩn lạc vi khuẩn

Cũng thuận tiện như phương pháp tăng sinh, có thể pha huyền dịch vi khuẩn trong môi trường lỏng hay trong nước muối sinh lý trực tiếp từ các khuẩn lạc vi khuẩn mọc trên mặt thạch nuôi cấy đã ủ 18 đến 24 giờ (nên dùng môi trường thạch không chọn lọc, như thạch thường hoặc thạch máu). Điều chỉnh huyền dịch vi khuẩn đạt độ đục chuẩn MacFarland 0,5 như trình bày ở phần trên.

Trải huyền dịch vi khuẩn trên mặt thạch

• Trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi khuẩn, dùng một que tăm bông vô khuẩn nhúng vào huyền dịch rồi lấy lên, ép và xoay nhẹ que tăm bông trên thành ống nghiệm. Động tác này sẽ bỏ bớt được lượng huyền dịch vi khuẩn thừa khỏi que tăm bông.
• Ria đầy vi khuẩn từ que tăm bông lên mặt thạch Muller-Hinton đã để tủ ấm trước đó 10 - 15 phút bằng máy tự tạo: Đặt ngửa đĩa thạch vào vị trí để đĩa trên máy, đặt tăm bông vào tâm đĩa thạch, bật máy, từ từ kéo tăm bông từ tâm ra ngoài rìa đĩa thạch, vừa kéo vừa xoay đều tăm bông. Làm như vậy khoảng 3 lần rồi tắt máy lấy đĩa thạch ra.
• Hé nắp hộp thạch đã ria vi khuẩn trong vòng 3 đến 5 phút, nhưng không quá 15 phút,  để cho khô mặt trước khi đặt đĩa kháng sinh lên mặt thạch.

Đặt khoanh giấy kháng sinh lên mặt thạch đã ria vi khuẩn   

• Tùy theo chủng vi khuẩn làm kháng sinh đồ, chọn bộ khoanh giấy kháng sinh thích hợp để đặt lên mặt thạch. Khi đặt, phải ép nhẹ mỗi khoanh giấy đó đảm bảo chúng tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch bằng kim lấy máu, mỗi đĩa 7 khoanh giấy kháng sinh, cách nhau 20 mm và cách thành đĩa 15 mm. Kháng sinh khuếch tán sau khi khoanh giấy kháng sinh chạm mặt thạch, vì vậy không được dời chỗ các khoanh giấy kháng sinh sau khi đã đặt lên mặt thạch.

Ủ đĩa thạch trong tủ ấm

• Trong vòng 15 phút sau khi đặt khoanh giấy kháng sinh, các đĩa thạch phải được lật úp để trong tủ ấm với nhiệt độ thích hợp. Đối với những vi khuẩn khó mọc, phải cho đĩa thạch vào tủ ấm có CO₂. Ngoại trừ vi khuẩn Haemophilus spp., và S. pneumoniae, không ủ hộp thạch trong khí trường CO₂ vì các tiêu chuẩn giải thích kết quả đều được xuất phát từ điều kiện ủ bình thường, và ngoài ra CO₂ còn có thể làm thay đổi đáng kể đường kính các vòng vô khuẩn.

Tên VSV	Nhiệt độ	Thời gian (giờ)	Điều kiện
Enterobacteriaceae	35 ± 2°C	16-18	Khí trường thường
Non-Enterobacteriaceae	35 ± 2°C	16-24	Khí trường thường
Vibrio cholera	35 ± 2°C	16-18	Khí trường thường
Staphylococcus	35 ± 2°C	16-18	Khí trường thường
Enterococcus	35 ± 2°C	16-24	Khí trường thường
Haemophylus	35 ± 2°C	16-18	Khí trường CO2 5%
Steptococcus	35 ± 2°C	16-24	Khí trường CO2 5%

 

IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

• Sau khi ủ 16 đến 18 giờ, đọc kết quả trên các hộp thạch. Nếu mặt thạch được ria canh khuẩn đúng cách, vi khuẩn sẽ mọc thành những khuẩn lạc mịn tiếp hợp nhau và vòng vô khuẩn sẽ là một vòng tròn đồng nhất. Nếu vi khuẩn mọc được thành những khuẩn lạc riêng lẻ (nồng độ vi khuẩn quá loãng) hoặc khuẩn lạc mọc chồng chéo lên nhau (nồng độ vi khuẩn quá đặc), phải làm lại thử nghiệm. Đo đường kính vòng vô khuẩn, kể cả đường kính khoanh giấy kháng sinh, hoàn toàn không có vi khuẩn mọc thấy được bằng mắt thường.
• Đo đường kính vòng vô khuẩn thành mi-li-mét tròn với thước compa trượt bằng cách áp thước lên mặt sau của đáy hộp thạch. Giữ hộp petri cách một mặt phẳng màu đen dưới ánh sáng phản chiếu vài cen-ti-mét. Nếu làm kháng sinh đồ trên thạch máu, đo đường kính vòng vô khuẩn trên mặt thạch đã mở nắp dưới ánh sáng phản chiếu. Nếu vi khuẩn thử nghiệm là Staphylococcus hay Enterococcus spp., thời gian ủ phải 24 giờ, và khi đọc kết quả phải dùng ánh sáng xuyên (tức là giữ hộp thạch trên một nguồn sáng) để có thế thấy được sự tăng trưởng nhẹ các chủng vi khuẩn kháng methicillin hay vancomycin ngay bên trong vòng vô khuẩn. Bất cứ một sự tăng trưởng nào thấy được bên trong vòng vô khuẩn đều chứng tỏ rằng vi khuẩn kháng methicillin hay vancomycin.
• Chu vi vòng vô khuẩn là vùng mà mắt thường không thể thấy được vi khuẩn mọc. Không cần để ý đến các khuẩn lạc vi khuẩn li ti hay sự tăng trưởng nhẹ của vi khuẩn thử nghiệm bên trong vòng vô khuẩn mà chỉ có thể thấy được bằng kính lúp. Tuy nhiên các khuẩn lạc vi khuẩn này cần phải được cấy, định danh và thử nghiệm lại. Các chủng Proteus spp. có thể mọc bò vào bên trong vòng vô khuẩn một số kháng sinh. Vì vậy với vi khuẩn Proteus spp. không cần để ý đến sự mọc lan này bên trong vòng vô khuẩn. Với khoanh giấy kháng sinh trimethoprim và sulfonamide, các chất đối kháng trong môi trường có thể cho phép sự tăng sinh nhẹ (20% hay ít hơn so với vùng vi khuẩn mọc) nên không cần phải để ý, bên trong vòng vô khuẩn và chỉ đo đường kính vòng vô khuẩn đến bờ rõ nét nhất của nó. Trên môi trường thạch kháng sinh đồ cho thêm máu, phải đo đường kính vòng vô khuẩn chứ không phải vòng ức chế tan huyết.
• Đường kính vòng vô khuẩn được so sánh với tiêu chuẩn của đường kính chuẩn; và ghi nhận kết quả vi khuẩn nhạy hay trung gian hay kháng đối với kháng sinh thử nghiệm.
• Chỉ đọc kết quả kháng sinh đồ chủng người bệnh khi kết quả QC đạt. Đo đường kính vùng ức chế (bao gồm cả đường kính của khoanh giấy kháng sinh) tính theo mm.
• Phiên giải đường kính vùng ức chế ra kết quả S, I, R theo hướng dẫn của CLSI cập nhật hàng năm

X. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

Môi trường cơ bản thực hiện kháng sinh đồ là thạch Muller-Hinton và phải đảm bảo yêu cầu sau:

• Thạch có chiều dày đồng nhất khoảng 4 ± 0,5 mm (đo chính xác 25ml môi trường để đổ vào đĩa đường kính 9cm).
• Môi trường thạch phải có pH từ 7,2 đến 7,4 ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và như vậy là phải đo pH sau khi thạch đặc lại. Một số kháng sinh (như aminoglycoside và macrolide) sẽ bị giảm hiệu lực nếu pH môi trường quá thấp trong khi một số kháng sinh khác (như penicillin) lại tăng hiệu lực. Nếu pH quá cao, có thể sẽ có ảnh hường ngược lại.
• Để nguội môi trường đông đặc ở nhiệt độ phòng xét nghiệm, nếu chưa sử dụng trong ngày, nên giữ trong tủ lạnh (2 đến 8⁰ C).
• Các hộp thạch MH hoặc MHB chỉ được dùng trong vòng 2 tuần kể từ ngày sản xuất.
• Đặt một mẫu đại diện cho mỗi loạt hộp thạch phải được kiểm tra ngoại nhiễm bằng cách ủ ở  tủ ấm 37⁰ C trong 24 giờ (Candida Select để ở tủ 30⁰ C).
• Nếu trước khi dùng, trên mặt thạch quá ẩm thì nên để hộp thạch hé nắp ở tủ ấm (35⁰ C) hay trong buồng khí lưu (laminar flow hood) từ 10 đến 15 phút cho đến khi khô mặt. Khi ria vi khuẩn, mặt thạch nên ẩm nhưng không có nước đọng trên mặt và cả trên nắp đậy.
• Phải dùng môi trường thạch Muller-Hinton chứa càng ít thymidine càng tốt.

Các khoanh giấy kháng sinh phải đảm bảo:

• Các lọ chứa khoanh giấy kháng sinh dùng hàng ngày được giữ ở 2-8⁰ C hay thấp hơn. Cách lọ khoanh giấy kháng sinh dự trữ phải để ở -14⁰ C hay thấp hơn cho đến khi dùng.
• Nên lấy các lọ chứa khoanh giấy kháng sinh còn đóng kín ra khỏi tủ lạnh trong khoảng 1 giờ để nhiệt độ trong lọ bằng với nhiệt độ phòng thí nghiệm trước khi mở nắp. Động tác này nhằm tránh các giọt nước đọng lại trên đĩa do khí ấm bên ngoài tiếp xúc với nhiệt độ lạnh của đĩa.
• Khi không sử dụng, các lọ chứa khoanh giấy kháng sinh phải luôn luôn được giữ trong tủ lạnh.

- Chỉ sử dụng các khoanh giấy kháng sinh cßn hạn dùng, loại bỏ các khoanh giấy  kháng sinh quá hạn.

Dùng các chủng chuẩn khi tiến hành song song làm KSĐ:

- Với các chủng trực khuẩn Gram âm dễ mọc dùng chủng E. coli ATCC 25922 và chủng  P. aeruginosa ATCC 27853.

- Với các cầu khuẩn Gram dương dễ mọc dùng các chủng S. aureus ATCC 25923

Vi khuẩn đặc biệt

• Môi trường Muller-Hinton nói ở trên để cho vi khuẩn hiếu khí mọc nhanh nhưng không đủ cho vi khuẩn khó mọc. Nếu làm KSĐ bằng phương pháp khuếch tán kháng sinh trong thạch trên các vi khuẩn khó mọc thì độ đục chuẩn là 1 MacFarland, môi trường và các tiêu chuẩn giải thích kết quả phải được thay đổi cho phù hợp.
• Với Streptococci thì phải dùng môi trường  Muller-Hinton có 5 -7% máu cừu (hoặc thỏ).
• Với Haemophilus spp và N. gonorrhoeae thì phải dùng môi trường Muller-Hinton Chocolate.

Một số lỗi mắc phải trong phương pháp kháng sinh khuếch tán

• Đọc sai khi đo đường kính vòng vô khuẩn;
• Bội nhiễm hay có những thay đổi khác trong chủng vi khuẩn kiểm tra;
• Huyền dịch vi khuẩn quá đặc hay quá loãng;
• Không lắc trộn đều độ đục chuẩn 0.5 McFarland hay độ đục chuẩn bị hỏng;
• Nhiệt độ hay khí trường ủ không đúng;
• Có sự khác nhau trong thực hành môi trường KSĐ (nên kiểm tra mỗi lô môi  trường mới trước khi dùng);
• Mất hàm lượng kháng sinh trong khoanh giấy trong quá trình dùng và bảo quản tại phòng xét nghiệm.

XI. AN TOÀN

• Phải trang bị bảo hộ cá nhân đầy đủ khi làm KSĐ;
• Tất cả các thao tác làm KSĐ phải được thực hiện trong tủ ATSH.

XII. HỒ SƠ LƯU

•  Lưu trữ các biểu mẫu phiếu QC theo đúng quy định của khoa.

XIII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

Tên tài liệu	Mã tài liệu
Quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm
Sổ tay hướng dẫn lấy mẫu bệnh phẩm
Hướng dẫn sử dụng tủ ấm
Quy trình trả kết quả xét nghiệm Khoa Vi Sinh