I. MỤC ĐÍCH

Mô tả quy trình tiến hành các bước nuôi cấy, định danh vi khuẩn bằng máy tự động VITEK2- COMPACT cho nhân viên khoa Vi Sinh thực hiện.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

Quy trình này áp dụng cho các nhân viên khoa Vi sinh, Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• Manual of Operation for VITEC Compact Automatic Machine (xem Quy trình làm xét nghiệm định danh và Kháng sinh đồ máy Vitek 2 compact15).
• Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-first Informational Supplement. This document provides updated tables for the Clinical and Laboratory Standards Institute antimicrobial susceptibility testing standards M02-A10 and M07-A8. January 2011

IV. TRÁCH NHIỆM

Nhân viên xét nghiệm khoa Vi Sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh có trách nhiệm thực hiện theo đúng quy trình

Người thực hiện: cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên nghành vi sinh, làm việc tại khoa Vi sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh

V.ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

Giải thích thuật ngữ

• Không áp dụng

Từ viết tắt

• SOP     =          Quy trình chuẩn (Standard of Procedure)
• KXN   =          Khoa Xét nghiệm
• ATSH =          An toàn sinh học

VI. NGUYÊN LÝ

Vi khuẩn sau khi nuôi cấy ở 37°C/ 18-24h (hoặc lâu hơn tùy theo từng loại vi khuẩn) được hòa trong 3ml nước muối 0.45% để tạo huyền dịch đồng nhất có độ đục theo yêu cầu đối với từng loại vi khuẩn, sau đó được máy hút vào thẻ xét nghiệm chứa các tính chất sinh vật hóa học. Máy sẽ giám sát sự phát triển và hoạt tính của vi sinh vật bên trong các giếng của thẻ xét nghiệm. Bộ phận quang học sử dụng ánh sáng nhìn thấy để đánh giá trực tiếp sự phát triển của vi sinh vật. Bộ phận quang học này dựa trên đọc ánh sáng ban đầu của mỗi giếng trước khi bắt đầu có sự phát triển. Máy đọc 15 phút/lần để đo sự phát triển của vi khuẩn trong mỗi giếng. Phần mềm so sánh kết quả thu được với cơ sở dữ liệu để đưa ra kết quả.

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

Thiết bị

• Tủ ấm
• Tủ an toàn sinh học
• Máy định danh VITEK2- COMPACT của Biomerieux và hệ thống máy tinh, máy in, lưu điện đi kèm
• Máy đo độ đục Vitek 

Dụng cụ

• Dispencer (dụng cụ bơm dung dịch nước muối 0,45%)
• Ống tube định danh 5ml
• Cassette có dán mã
• Pipet
• Đèn cồn, que cấy

Hóa chất, thuốc thử

• Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: hạch máu, thạch định danh (Uti agar/chromatic detection…), môi trường phân lập vi khuẩn (Macconkey agar, SS agar, TCBS agar,…), Môi trường tang sinh (BHI, BHI agar,…)
• Bộ test tính chất sinh vật hóa học (KIA, mannit di dộng, ure indol, citrate simmon agar, RM – VP, …)
• Cạrd định danh vi khuẩn gồm: Card GN cho vi khuẩn Gram âm và card GP cho vi khuẩn Gram dương, card NH cho vi khuẩn Neisseria spp, Haemophilus spp, … và một số vi khuẩn khó định danh, card ANC cho vi khuẩn kỵ khí và coryneform bacteria. Card được bảo quản 2-8°C
• Dung dịch nước muối 0,45%.

VIII. NỘI DUNG

1. Nuôi cấy

• Các bệnh phẩm được nuôi cấy trên môi trường thích hợp, ủ ở 37°C/ 18-24h hoặc 12-48h.
• Đọc bệnh phẩm, chọn vi khuẩn muốn định danh cấy thuần sang đĩa môi trường khác theo từng loại card quy định, sau đó ủ ở 37°C/ 18-24h hoặc 12-48h (Nếu vi khuẩn mọc thuẩn thì có thể bỏ qua bước này).

2. Định danh

• Chuẩn bị chủng vi sinh vật cần định danh đã thuần theo đúng yêu cầu về môi trường và điều kiện ủ:

Loại thẻ	Môi trường	Khuẩn lạc, Giờ	Điều kiện ủ
Trực khuẩn Gram âm – GN	- Trypticase agar - Columbia Blood agar - Macconkey agar - ChromID CPS	18- 24	35-37oC, hiếu khí
Cầu khuẩn Gram dương – GP	- Trypticase agar - Columbia Blood agar - ChromID CPS	12- 48	35-37oC, hiếu khí Strepto: 5-10% CO2 Micrococci: no CO2

• Chuẩn bị Worksheet cho cassette (Điền các thông tin cần biết về bệnh nhân như tên, lab ID…): Vào “enter casette manager” – chọn “setup tests post  entry” – chọn Print – chọn “Bank cassette worksheet” – nhấn “OK” để in;
• Chuẩn bị Card: lấy card ra khỏi tủ lạnh và để ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút;
• Pha huyền dịch tube định danh:
  1. Lấy ống nghiệm vô trùng kích thước 12 x 0.75 cm (chú ý: không chạm tay vào miệng ống nghiệm) đặt trên khay cassette
  2. Dùng dispenser hút 3ml nước muối 0.45% vào ống nghiệm
  3. Kiểm tra máy đo độ bằng bộ chuẩn máy theo hướng dẫn sử dụng của máy DENSICHEK PLUS sau đó chuẩn 0 bằng nước muối
  4. Sử dụng ăng cấy vô trùng lấy các khuẩn lạc đã phân lập, nghiền kỹ trên thành ống, trộn đều và đưa vào máy đo đô độ đục DENSICHEK PLUS: đạt nồng độ 0.5 – 0.63 McF (card GN và GP), nồng độ 2,70 – 3,30 McF (card NH và ANC), nồng độ 1,80 – 2,20 McF (card YST).
  5. Đặt ống tube vào casstte. Đặt thẻ định danh vào ống tube.
• Chạy máy:
  1. Nếu máy đã sẵn sàng (màn hình hiện Start Fill và OK): mở cửa buồng hút, cho cassette vào và nhấn Start Fill.
  2. Khi đèn báo nhấp nháy (sau khoảng 2 phút), màn hình báo “Tranfer” thì mở cửa buồng hút lấy cassette ra và mở của buồng vận hành rồi cho cassette vào. Đóng cả hai cửa và đợi.
  3. Nhập thông tin cassette: Nếu bệnh phẩm của cùng bệnh nhân thì chọn tất cả các hang rồi vào Difine Isolate để nhập thông tin: ID lab, số vi khuẩn. Vào Bench name để chọn tên người thực hiện. Nhấn Save cassette data để xác nhận. Nếu chỉ làm riêng cạc kháng sinh đồ thì phải chọn tên vi khuẩn cho cạc kháng sinh đồ đó.
  4. Nhập thông tin bệnh nhân: Vào “View and Maintain Patient Information” (Biểu tượng hình người). Vào Add patient để thêm bệnh nhân. Nhập các thông tin có dấu * đỏ (bắt buộc). Nhấn save để xác nhận.

IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

• Dữ liệu sẽ được tự động ghi vào phần mềm trên máy tính. Phần mềm phân tích kết quả và xác định vi sinh vật dựa và các phản ứng sinh hóa.
• Kết quả định danh

 

Mức độ tin cậy	Các sự lựa chọn	Xác suất	Khuyến cáo
Xuất sắc	1	96 – 99%
Rất tốt	1	93 – 95%
Tốt	1	89 – 82%
Chấp nhận được	1	85 – 88%
Phân biệt thấp Low discrimination	2 hoặc 3	Tổng phần trăm = 100,	2 hoặc 3 loài có cùng cơ sở giống nhau. Phân biệt bằng các test phụ.
Không xác định	0

X. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

• Kiểm tra QC môi trường nuôi cấy bằng chủng chuẩn như: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 25922, Salmonella enteria ATCC 14018, Haemophilus influenza ATCC 10211....
• Kiểm tra QC bằng chủng chuẩn Enterobacter hormaechei đối với Card định danh GN và Enterococcus casseliflavus ATCC 700327 đối với Card định danh GP.
• So sánh với phương pháp định danh bằng thanh định danh API để tham chiếu.

Lưu ý:

• Thiết bị sử dụng cho chẩn đoán in vitro
• Không sử dụng thẻ xét nghiệm hết hạn sử dụng chỉ ra trên bao bì sản phẩm
• Bảo quản các thẻ xét nghiệm trong đóng gói kín. Không sử dụng thẻ xét nghiệm nếu túi tráng nhôm chứa thẻ bị rách
• Để các thẻ xét nghiệm trong đóng gói của nó cân bằng ở nhiệt độ phòng trước khi xét nghiệm
• Không sử dụng găng tay có bột vì bột có thể gây ảnh hưởng đến đọc quang
• Sử dụng môi trường nuôi cấy, điều kiện ủ, thời gian nuôi cấy khuẩn lạc theo đúng khuyến cáo của nhà sản xuất.
• Khuẩn lạc định danh phải thuần
• Thực hiện nhuộm Gram trước khi xét nghiệm để xác định nhóm vi khuẩn và hình thái trước khi lựa chọn thẻ định danh.
• Thời gian chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn trước khi cho vào máy tối đa là 30 phút
• Dispenser phân phối nước muối khử khuẩn định kỳ đảm bảo vô khuẩn: 1 tuần/lần hoặc khi có nghi ngờ để tránh nhiễm chai nước muối gây ảnh hưởng đến kết quả.
• Thời gian chuyển từ buồng hút sang buồng vận hành kỹ thuật: tối đa 10 phút. Nếu không chuyển trong thời gian cho phép thì phải hủy thẻ xét nghiệm vì sẽ ảnh hưởng đến kết quả
• Không mở cửa buồng vận hành khi chưa có tín hiệu cho phép. Nếu tự ý mở cửa máy sẽ báo lỗi và dừng hoạt động.

XI. AN TOÀN

• Thực hiện bảo hộ cá nhân đầy đủ khi tiếp xúc với chủng vi khuẩn.
• Các bước phải được tiến hành trong tủ ATSH
• Phòng tránh lây nhiễm chéo

XII. HỒ SƠ LƯU

• Sổ đọc bệnh phẩm
• Sổ lưu kết quả nuôi cấy
• Sổ nội kiểm vitek

XIII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

• VITEK 2 System Product Information, EN 41097
• VTIEK 2 Technology Software User manual
• VITEK 2 Compact Instrument User manual