I. MỤC ĐÍCH

Mô tả quy trình hướng dẫn kĩ thuật làm giá đường Api 20STREP để định danh vi khuẩn cho nhân viên phòng nuôi cấy thực hiện.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

Quy trình này áp dụng cho các nhân viên phòng nuôi cấy, khoa Vi sinh, Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• REF 20 600 (http://www.biomerieux.com)

IV. TRÁCH NHIỆM

Nhân viên xét nghiệm khoa vi sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh có trách nhiệm thực hiện theo đúng quy trình

Người thực hiện: cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên nghành vi sinh, làm việc tại khoa Vi sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh

V.ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

Giải thích thuật ngữ

• Không áp dụng

Từ viết tắt

• SOP     =          Quy trình chuẩn (Standard of Procedure)
• KXN   =          Khoa Xét nghiệm
• ATSH =          An toàn sinh học
• Strep   =          Streptococci

VI. NGUYÊN LÝ

Các men sinh các phản ứng trên có sẵn trong vi khuẩn được tiết ra môi trường xung quanh. Khi ở nồng độ vi khuẩn đậm đặc bằng Mac Farland 4 trong điều kiện ủ ấm 35- 37^oC sau 18- 24 giờ tác dụng với cơ chất thử nghiệm, kết quả có thể đọc bằng mắt thường.

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

Thiết bị

• Tủ an toàn sinh học
• Tủ ấm CO₂
• Máy vi tính và phân mềm đọc giá đường Api (Api web) hoặc sách “API 20Strep Analytical Profile Index”.
• Máy đo độ đục Vitek 

Dụng cụ

• Pipet nhựa vô khuẩn 1ml
• Ống thủy tinh vô khuẩn 5ml
• Đèn cồn, que cấy
• Lam kính, giấy thấm
• Hộp nhựa để ủ giá đường

• Bảo hộ lao động: găng tay, khẩu trang, mũ giấy….

Hóa chất, thuốc thử

• Thanh Api 20Strep
• Nước muối sinh lý (NaCl 0.85%) hoặc Api Suspension medium 2 ml
• GP Medium
• VP1+VP2, NIN,  ZYM A, ZYM B
• Parafin

VIII. NỘI DUNG

Bệnh phẩm

• Chủng vi khuẩn chi Streptoccoci được nuôi cấy qua đêm (18 – 24 giờ) trên môi trường thạch máu.
• Chủng thuần, được nuôi cấy qua đêm (18 – 24 giờ)

Kỹ thuật tiến hành

• Chuẩn bị cho thanh Api 20Strep:

+ Lấy 1 hộp ủ nhựa (khay và nắp cung cấp kèm trong hộp Api) và cho khoảng 5ml nước cất hoặc nước sinh hoạt vào đầy các lỗ trên khay. Ghi lại các thông tin của mẫu cần chạy lên khay (số bệnh phẩm, ngày giờ thực hiện…);

+ Lấy thanh Api 20Strep  ra khỏi vỏ;

+ Đặt thanh Api 20Strep vào trong hộp ủ.

• Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn:

Đốt que cấy để nguội sau đó lấy vài khuẩn lạc vi khuẩn cần phân lập (đã được nuôi cấy 24-48h trên thạch máu) pha vào 2 ml dung dịch ống Suspension Medium 2 ml (có sẵn trong bộ API), tạo độ đục tương đương MacFarland 4

• Tiến hành ủ:

+ Dùng pipét vô trùng hút dung dịch đã pha nhỏ vào đầy vừa phải vào các giếng từ VIP đến ADH. Chú ý: không để tạo bọt trong giếng

+ Lấy 0,5ml dung dịch trên cho vào ống GP Medium (có sẵn trong bộ API), trộn đều

+ Nhỏ vừa đủ vào các giếng từ RIB đến GLYG. Nhỏ đầy dung dịch dầu paraphin vào các giếng có gạch chân từ ADH đến GLYG

+ Đậy hộp nhựa ủ ấm thanh API vào tủ ấm CO₂.

• Đọc kết quả: Sau giai đoạn ủ ta lấy giá đường ra và đọc kết quả âm tính hay dương tính của các giếng theo bảng phụ lục.

+ Nhỏ hoá chất: nhỏ 1 giọt VP1 và VP2 vào giếng VP, nhỏ 1 giọt NIN vào giếng HIP, nhỏ 1 giọt JYM A và JYM B vào giếng PYRA, a-GAL, b-GUR, b-GAL, PAL và LAP. Đọc kết quả sau 10 phút.

IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

• Chấm điểm: Có 20 giếng được chia thành 7 nhóm, mỗi nhóm có 3 giếng (nhóm cuối cùng có hai giếng và kết quả oxydase test được tính là ô thứ 3):

Giếng đầu tiên dương tính được:      1 điểm                        âm tính: 0 điểm

Giếng thứ hai dương tính được:        2 điểm            âm tính : 0 điểm

Giếng thứ 3 dương tính được:           4 điểm                        âm tính : 0 điểm

• Xác định mã số: tính điểm tổng số điểm của các giếng trong cùng một nhóm ta có số điểm của nhóm đó. Theo thư tự, số điểm của các nhóm lập thành một mã số có 7 chữ số (có 7 nhóm).
• Xác định tên vi khuẩn: dùng mã số vừa xác định được tra bằng sách, hoặc bằng phần mềm do hãng cung cấp để có được tên vi khuẩn với xác suất nhất định.
• Trường hợp không định danh được (không có mã số hoặc mã số không cho kết quả) ta phải ủ thêm 24 giờ nữa rồi đọc lại kết quả (chỉ đọc kết quả phản ứng các giếng ESC, ADH, và từ RIB đến GLYG).

X. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

• Không sử dụng hóa chất hết hạn
• Kiểm tra xem sự nguyên vẹn của hóa chất: có bị hở không? có vỡ không?...
• Không sử dụng các thanh đã bị hỏng: biến dạng, bị khô….
• Thực hiện đúng các theo qui trình và hướng dẫn của nhà cung cấp
• Cân nhắc trước khi trả kết quả: liên hệ với bệnh sử, nguồn gốc bệnh phẩm, tính thuần chủng, hình thái quan sát được dưới kính hiển vi; nếu cần thiết, thực hiện riêng biệt từng test .
• Các thao tác được thực hiện trong tủ ATSH và đảm bảo nguyên tắc vô trùng

XI. AN TOÀN

• Kít này có nguồn gốc từ động vật và đảm bảo không bị lây nhiễm các mầm bệnh. Tuy nhiên các sản phẩm này vẫn phải được xử lý như một nguồn lây nhiễm tiềm ẩn.
• Tất cả các bệnh phẩm nuôi cấy vi khuẩn và các sản phẩm liên quan phải được xử lý như là nguồn lây nhiễm.
• Kỹ thuật vô khuẩn và các biện pháp phòng ngừa cần được tuân thủ trong suốt quá trình tiến hành.

XII. HỒ SƠ LƯU

• Giá đường Api 20Strep và Api 20Strep reagent kit được bảo quản ở 2⁰ C – 8⁰ C và được lấy ra để ở nhiệt độ thường 10 phút trước khi sử dụng-
• Các hóa chất ZYM A, ZYM B, NIN, VP1, VP2 chỉ dùng trong vòng 1 tháng từ khi mở nắp;
•    ZYM B và NIN rất nhạy cảm với ánh sáng nên phải bọc giấy bạc khi sử dụng. Bình thường ZYM B có màu vàng, khi có màu hồng xuất hiện thì ta phải bỏ, không sử dụng nữa;
• Canh khuẩn pha xong phải được sử dụng ngay
• Khi giá đường đã được ủ 24 giờ mà ta chưa đọc kết quả được ngay thì phải để vào ngăn mát của tủ lạnh (2⁰ C – 8⁰ C)
• Trường hợp mã số không cho kết quả thì ta phải làm lại và định danh bằng phương pháp khác nếu có thể (ví dụ: định danh bằng máy Vitek Compact)

XIII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN: Không áp dụng