71. NHUỘM HEMATOXYLIN- EOSIN (HE) CÁC MẢNH CẮT MÔ

 

I.                       NGUYÊN LÝ   

Đây là phương pháp nhuộm hai màu liên tiếp. Nhuộm nhân theo nguyên tắc tăng dần, nhuộm bào tương theo nguyên tắc giảm dần.

II.                    CHUẨN BỊ

1.                      Người thực hiện

Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02.

2.1.              Phương tiện, hóa chất chung cho kỹ thuật

 

-  Dung dịch cố định bệnh phẩm. - Cồn (700, 800, 950 , 1000). -  Xylen hay toluen. -  Nước cất 2 lần. -  Parafin. -  Sáp ong. -  Albumin + glyxerin. -  Máy đo độ pH điện tử. -  Máy chuyển bệnh phẩm tự động. -  Máy đúc khối parafin. -  Bàn hơ dùng điện. -  Máy cắt lát mỏng (microtome). -  Lưỡi dao cắt lát mỏng. -  Lò nấu parafin. - Tủ ấm 370  và 560. -  Tủ lạnh. -  Điều hòa nhiệt độ. -  Tủ hốt phòng thí nghiệm. -  Nguồn cấp nước chảy.

-  Bể nhuộm bằng thủy tinh. -  Bể thủy tinh đựng cồn, xylen. -  Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin. -  Khuôn nhựa. -  Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang). -  Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml. -  Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất. -  Kẹp không mấu, kéo. -  Cân phân tích. -  Giấy lọc. -  Phiến kính, lá kính. -  Axit picric ngâm, làm sạch phiến kính. -  Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính. -  Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm. -    -   mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.

2.2.              Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật

Phẩm nhuộm: Phẩm nhuộm nhân và bào tương có thể mua dạng thương mại, dùng luôn. Nếu không có sản phẩm dùng ngay, có thể pha phẩm nhuộm theo cách thức dưới đây:

a.                 Hematoxylin Harris :

-                  Hematoxylin (tinh thể)                             1g

-                  Cồn (etanol) tuyệt đối                              10ml

-                  Alun (ammonium hay potassium)            20g

-           Nước cất                                                   200ml

-           Oxyt thuỷ ngân (đỏ)                                 0,5g

* Tiến hành pha :

1.           Hoà tan hematoxylin trong cồn.

2.            Hoà tan alun trong nước cất nóng. Đưa ra khỏi lửa và trộn hai dung dịch với nhau.

3.          Đun sôi hỗn hợp, kéo bình đun ra khỏi lửa và thêm vào dần oxyt thuỷ ngân.

4.           Đun nóng lại, khi hỗn hợp có màu tím sẫm, tắt lửa và nhúng ngay bình đun vào nước lạnh.

5.             Khi bình đun lạnh hẳn, thêm 2ml axit acetic lạnh để làm tăng tính nhuộm nhân.

b.           Eosine Y : ở Việt Nam thường pha dung dịch 0,5% trong cồn 95o.

L.G. Koss pha theo công thức :

Eosine Y (CI. No 45830)             16g hoặc 1g Dichromat kali            8g hoặc 0,5g Axit picric 

                                                    160ml hoặc 10ml Cồn etanol 95o       160ml  hoặc 10ml

Nước cất                                      1280 ml hoặc 80ml

-            Hoà tan eosin và dichromat kali vào nước cất, đun nóng nếu cần, sau đó thêm dung dịch axit picric, cồn.

III.                CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1.                      Cố định: Bệnh phẩm lấy ra khỏi cơ thể được đưa ngay vào dung dịch cố định (formol đệm trung tính 10%) với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20- 30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-24 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.

Sau khi cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:

2.                      Chuyển bệnh phẩm

3.                      Vùi parafin

4.                      Đúc khối parafin

5.                      Cắt và dán mảnh cắt

6.                      Nhuộm

Thực hiện các bước sau:

-        Tẩy parafin trong 3 bể toluen (hoặc xylen), mỗi bể 5 phút.

-   Qua 4 bể cồn: 100º - 95º - 80º - 70º, mỗi bể nhúng 15 lần.

-        Rửa nước cất: Nhúng 15 lần.

-        Nhuộm nhân bằng Hematoxylin Harris: 3-5 phút hoặc lâu hơn.

-        Rửa nước chảy: 5-10 phút.

-        Kiểm tra màu của nhân qua kính hiển vi, nếu đậm, tẩy nhẹ bằng cồn-axit.

-        Rửa nước chảy: 1phút.

-        Nhuộm Eosin1% : 1 -2 phút.

-        Rửa nước chảy: 1 phút.

-        Biệt hoá trong 2 bể cồn 95º - 100º, mỗi bể 15 lần nhúng.

-        Qua 3 bể toluen, bể I và II nhúng 15 lần, bể III: 5-10 phút.

-          Gắn lá kính

IV.                KẾT QUẢ

Nhân tế bào                       xanh đến xanh đen

Bào tương tế bào               hồng đến đỏ

Hồng cầu                           hồng đậm

Sợi tạo keo                        hồng nhạt.

V.                    NHỮNG SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

-  Bào tương và nhân đều bắt màu nhạt: Thuốc nhuộm cũ, thay thuốc nhuộm mới.

-  Nhân nhạt màu: Tăng thời gian nhuộm nhân.

-  Nhân đậm màu quá mức: tẩy nhẹ bằng cồn-axit.

 

72. NHUỘM PERIODIC ACID SCHIFF (PAS)

 

I.                       NGUYÊN LÝ

Đây là kỹ thuật nhuộm chất nhầy với nguyên lý dùng tác nhân oxy hóa là axit periodic để phá vỡ mối liên kết của 2 nguyên tử các bon (các nhóm glycol 1-2, hydro-1 amino-2, hydroxy-1 alkylamino-2, hydroxyl -1ceto-2…) làm   xuất

hiện các nhóm aldehyt. Các nhóm aldehyt này nhìn được nhờ phản ứng với thuốc thử Schiff.

II.                    CHUẨN BỊ

1.                      Người thực hiện

Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02.

2.1.              Phương tiện, hóa chất chung cho kỹ thuật

 

-  Dung dịch cố định bệnh phẩm. - Cồn (700, 800, 950 , 1000). -  Xylen hay toluen. -  Nước cất 2 lần. -  Parafin. -  Sáp ong. -  Albumin + glyxerin. -  Máy đo độ pH điện tử. -  Máy chuyển bệnh phẩm tự động. -  Máy đúc khối parafin. -  Bàn hơ dùng điện. -  Máy cắt lát mỏng (microtome). -  Lưỡi dao cắt lát mỏng. -  Lò nấu parafin. - Tủ ấm 370  và 560. -  Tủ lạnh. -  Điều hòa nhiệt độ. -  Tủ hốt phòng thí nghiệm. -  Nguồn cấp nước chảy.

-  Bể nhuộm bằng thủy tinh. -  Bể thủy tinh đựng cồn, xylen. -  Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin. -  Khuôn nhựa. -  Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang). -  Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml. -  Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất. -  Kẹp không mấu, kéo. -  Cân phân tích. -  Giấy lọc. -  Phiến kính, lá kính. -  Axit picric ngâm, làm sạch phiến kính. -  Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính. -  Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm. -

2.2.              Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật

Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở 6.1 dưới đây), bao gồm: Thuốc thử Schiff, axit periodic, hemalun Mayer.

III.                CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1.                      Cố định

Bệnh phẩm lấy ra khỏi cơ thể được đưa ngay vào dung dịch cố định (formol đệm trung tính 10%) với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp   20-30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-24 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.

Sau khi cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:

2.                      Chuyển bệnh phẩm

3.                      Vùi parafin

4.                      Đúc khối parafin

5.                      Cắt mảnh và dán mảnh

6.                      Nhuộm tiêu bản

6.1.              Chuẩn bị thuốc nhuộm

a.                      Thuốc thử Schiff

 

Hòa tan basic fuchsin (hoặc pararosanilin) với nước cất đun sôi Lắc mạnh, để nguội đến 50ºC, lọc Cho thêm HCl 1N vào dịch đã lọc Để nguội tới 25 ºC Cho thêm sodium (hoặc potassium) metabisunfit

1g 200ml 20ml 1g

b.                      Axit Periodic

 

Axit periodic Nước cất

1g 100ml

6.2.              Tiến hành kỹ thuật

1. Tẩy parafin bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút.

2. Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80°, 700  mỗi bể 2 phút.

3. Ngâm trong nước cất: 10 phút.

4. Oxy hóa trong axit periodic 1%: 10 phút.

5. Rửa nước chảy: 5 – 10 phút rồi cho vào nước cất.

6. Ngâm trong thuốc thử Schiff: 15- 30 phút (hoặc thấy có màu hồng là được).

7. Nhuộm nhân bằng hemalum Mayer: khoảng 1phút.

8. Rửa nước chảy trong 5 phút.

9. Đẩy nước bằng cồn 95° và 100°

10.                 Làm trong qua 3 bể toluen sạch

11.                 Gắn lá kính bằng bôm như thường lệ

IV.                NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

-           Nhân tế bào:                          xanh đen

-           Nấm, chất nhầy:                    hồng đậm tới đỏ

-           Glycoprotein:                        đỏ

-           Glycogen:                               đỏ

-           Chất nền:                               màu ve

V.                    MỘT SỐ LƯU Ý, SAI SÓT VÀ CÁCH XỬ TRÍ

Dung dịch (thuốc thử Schiff) đựng trong lọ sạch, đậy nút kín, để ở nhiệt độ phòng tại nơi tối. Sau 24 giờ, nếu dung dịch chuyển thành màu vàng rơm là được.

Trong trường hợp dung dịch không chuyển màu, cho thêm 2g than hoạt, lắc nhanh rồi lọc ngay. Bảo quản trong lọ màu, nút kín ở nhiệt độ 4ºC. Dung dịch pha này có thể dùng trong vài tháng. Loại bỏ khi dung dịch chuyển thành màu hồng.

 

73. NHUỘM XANH ALCIAN (theo Mowry,1960)

 

I.                       NGUYÊN LÝ

Đây là kỹ thuật nhuộm xác định các loại chất nhầy khác nhau (loại axit, trung tính hoặc kiềm, thường được áp dụng cho các tổn thương đường tiêu hóa). Nguyên lý dựa vào tính chất thuốc nhuộm cation và hình thành các liên kết với các anion nhất định trong mô mang nhóm carboxyl hoặc nhóm sunfat, tạo nên

các liên kết tĩnh điện cation-anion. Gốc photphat của axit nhân không sẵn sàng liên kết với thuốc nhuộm xanh alcian. Có thể nhuộm xanh alcian ở các độ pH khác nhau để phân biệt các chất nhầy axit.

II.                    CHUẨN BỊ

1.                      Người thực hiện

Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02.

2.1.              Phương tiện, hóa chất chung cho kỹ thuật

 

-  Dung dịch cố định bệnh phẩm. - Cồn (700, 800, 950 , 1000). -  Xylen hay toluen. -  Nước cất 2 lần. -  Parafin. -  Sáp ong. -  Albumin + glyxerin. -  Máy đo độ pH điện tử. -  Máy chuyển bệnh phẩm tự động. -  Máy đúc khối parafin. -  Bàn hơ dùng điện. -  Máy cắt lát mỏng (microtome). -  Lưỡi dao cắt lát mỏng. -  Lò nấu parafin. - Tủ ấm 370  và 560. -  Tủ lạnh. -  Điều hòa nhiệt độ. -  Tủ hốt phòng thí nghiệm. -  Nguồn cấp nước chảy.

-         Bể nhuộm bằng thủy tinh. -         Bể thủy tinh đựng cồn, xylen. -         Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin. -         Khuôn nhựa. -         Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang). -         Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml. -         Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất. -         Kẹp không mấu, kéo. -         Cân phân tích. -         Giấy lọc. -         Phiến kính, lá kính. -         Axit picric ngâm, làm sạch phiến kính. -         Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính. -         Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm. -

2.2.              Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật

Thuốc nhuộm xanh alcian được pha theo hướng dẫn ở mục 6.1. dưới đây.

III.                CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1.                      Cố định: Bệnh phẩm lấy ra khỏi cơ thể được đưa ngay vào dung dịch cố định (formol đệm trung tính 10%) với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20- 30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-24 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ. Sau khi cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:

2.                      Chuyển bệnh phẩm

3.                      Vùi parafin

4.                      Đúc bệnh phẩm

5.                      Cắt và dán mảnh cắt

6.                      Nhuộm mảnh cắt

6.1.              Chuẩn bị thuốc nhuộm

* Pha dung dịch xanh alcian 1% trong axit acetic3% (pH 2,5)

Xanh alcian                                 1g

Axit acetic 3%                             100ml

Hòa tan xanh alcian trong axit acetic. Lọc trước khi sử dụng.

* Pha dung dịch xanh alcian 1% trong axit hydrochloric 0,1M (pH 1,0)

Xanh alcian                                 1g

Axit hydrochloric 0.1M              100ml

Hòa tan xanh alcian trong axit hydrochloric. Lọc trước khi sử dụng.

* Pha dung dịch natri cacbonat 0,3%

Natri cacbonat                            0.3 g

Nước cất                                      100ml

Hòa tan natri cacbonat trong nước cất, lắc đều cho đến khi tan hết.

6.2.              Tiến hành nhuộm

1.                          Tẩy nến trong toluen 3 lần, mỗi lần 2 phút

2.                          Chuyển vào bể cồn 100°, 95°, 80°  mỗi bể 2 phút

3.                          Rửa nước chảy  5 phút

4.                          Đặt trong dung dịch axit acetic 3%  trong 2 phút

5.                          Nhuộm trong dung dịch xanh alcian 1%: 30 phút

6.                          Rửa nước chảy 5 phút

7.                          Để trong dung dịch natri cacbonat 0.3% trong 30 phút

8.                          Rửa nước chảy 5 phút

9.                          Nhuộm nhân trong Hematoxylin Mayer : 7 phút

10.                     Rửa nước chảy 5 phút

11.                     Loại nước bằng cồn 80, 95°, 100°.

12.                     Làm trong qua 3 bể toluen.

13.                    Gắn lá kính bằng bôm Canada

IV.                ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ

Chất nhầy axit:                           màu xanh ngọc

Nhân tế bào:                               màu xanh nhạt

V.                    NHỮNG SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

1.                      Những sai sót và xử trí khi nhuộm nói chung

-  Mảnh cắt bị bong, gấp quá nhiều:

+ Có thể do cố định bệnh phẩm không tốt: không khắc phục được hoặc phải lấy bệnh phẩm mới và làm lại kỹ thuật.

+ Do cắt quá dày hoặc dán mảnh cắt không tốt: cắt và dán lại mảnh cắt, nhuộm lại.

+ Mảnh cắt bị rách, nhăn hoặc giãn quá mức: do cắt bị vấp hoặc do dàn mảnh cắt quá mức hoặc bàn hơ quá nóng. Cần điều chỉnh nhiệt độ và cắt nhuộm lại nếu cần.

-  Nhân tế bào và chất nhày bắt màu yếu: tăng thời gian nhuộm.

-  Nhiều bọt khí, hơi nước trong tiêu bản:gắn lá kính thật nhanh, ngay khi nhấc qua bể toluen, thực hiện kỹ thuật trong phòng khô (có điều hòa, máy hút ẩm, đặc biệt vào những khi thời tiết có độ ảm cao).

-  Mảnh cắt bị khô, bay mất thuốc nhuộm, không đánh giá được: cần phủ kín mảnh cắt bằng lá kính, gắn đủ bôm hoặc chất gắn lá kính.

2.                      Những sai sót và xử trí khi nhuộm  xanh alcian

-  Chất nhầy axit không bắt màu: Kiểm tra lại để đánh giá chính xác độ pH của thuốc nhuộm.

-  Tùy thuộc chất nhày axit loại nào sẽ bắt màu ở các độ pH 1 hay 2,5, nên phải đánh giá sự bắt màu chất nhày theo loại mô được nhuộm.

 

74. NHUỘM GIEMSA TRÊN MẢNH CẮT MÔ PHÁT HIỆN HELICOBACTER PYLORI

I.                       NGUYÊN LÝ

Các vi khuẩn Helicobacter Pylori bắt màu tím đỏ ở khe tuyến, vùng chất nhầy trên bề mặt biểu mô phủ dạ dày.

II.                    CHUẨN BỊ

1.                      Người thực hiện

Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02

2.                      Phương tiện, hóa chất

2.1.              Phương tiện, hóa chất chung

 

-           Dung dịch cố định bệnh phẩm. - Cồn (700, 800, 950 , 1000). -           Xylen hay toluen. -           Nước cất 2 lần. -           Parafin. -           Sáp ong. -           Albumin + glyxerin. -           Máy đo độ pH điện tử. -           Máy chuyển bệnh phẩm tự động. -           Máy đúc khối parafin. -           Bàn hơ dùng điện. -           Máy cắt lát mỏng (microtome). -           Lưỡi dao cắt lát mỏng. -           Lò nấu parafin. - Tủ ấm 370  và 560. -           Tủ lạnh. -           Điều hòa nhiệt độ. -           Tủ hốt phòng thí nghiệm. -           Nguồn cấp nước chảy.

-         Bể nhuộm bằng thủy tinh. -         Bể thủy tinh đựng cồn, xylen. -         Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin. -         Khuôn nhựa. -         Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang). -         Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml. -         Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất. -         Kẹp không mấu, kéo. -         Cân phân tích. -         Giấy lọc. -         Phiến kính, lá kính. -         Axit picric ngâm, làm sạch phiến kính. -         Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính. -         Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm. -

2.2.              Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật

Phẩm nhuộm: hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.6.1 dưới đây:

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1.                      Cố định

Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 -30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-12 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ. Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:

2.                      Chuyển bệnh phẩm

3.                      Vùi parafin

4.                      Đúc khối parafin

5.                      Cắt và dán mảnh cắt

6.                      Nhuộm mảnh cắt

6.1.              Chuẩn bị phẩm nhuộm

+ Hoàn tan 0,8g Giemsa vào 100ml hỗn dịch glycerol và metanol với khối lượng bằng nhau, lắc đều 2-3 ngày trong bình lắc cơ học.

+ Lọc hỗn dịch trên và coi là dung dịch Giemsa mẹ.

+ Khi dùng, lấy Giemsa mẹ pha loãng với nước cất, tỷ lệ Giemsa/nước cất là 1/4. Lưu ý là độ pH nên bằng 7,2 và được điều chỉnh bằng đệm photphat.

6.2.              Các bước tiến hành

+ Mảnh cắt được tẩy nến như thường lệ (qua xylen, cồn).

+ Rửa nước

+ Nhuộm tiêu bản trong dung dịch Giemsa đã pha loãng trong 1 giờ.

+ Rửa nước

+ Biệt hóa trong axit acetic loãng (1 giọt axit acetic với 100ml nước cất)

+ Rửa nước

+ Loại phẩm thừa bằng cồn 950

+ Loại nước bằng xylen

+ Gán lá kính bằng bôm Canada.

IV.                NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Các vi khuẩn Helicobacter Pylori (HP) bắt màu tím đỏ.

V.                    MỘT SỐ SAI SÓT VÀ CÁCH XỬ TRÍ

-  Các mảnh cắt quá dầy, không có phần niêm mạc sẽ không phát hiện được HP.

-  Dung dịch dán mảnh cắt bị nhiễm khuẩn: sẽ ngộ nhận các vi khuẩn khác với HP, trường hợp này cần thay dung dịch dán mảnh cắt.

-  Thời gian nhuộm lâu hoặc nồng độ Giemsa cao đều làm cho mô bắt màu mạnh, chuyển màu xanh đen, khó nhận định kết quả, xử lý bằng cách làm nhạt màu qua cồn.

-  Nước dùng để rửa có nhiều cặn bẩn gây cặn bẩn trên tiêu bản, khó đánh giá kết quả, cần sử dụng nguồn nước sạch và sử dụng lõi lọc nếu cần.

-  Thuốc nhuộm cũng có thể bị cặn và nhiễm vi khuẩn làm ảnh hưởng đến việc đánh giá kết quả, nên thay thuốc nhuộm mới.

-  Dung dịch Giemsa pha loãng chỉ pha trước khi nhuộm.