I. MỤC ĐÍCH

            Xác định RNA đặc trưng của Dengue bằng hệ thống tự động.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

      Áp dụng tại Khoa xét nghiệm Vi sinh - Bệnh viện đa khoa Tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• Quyết định 26/QĐ-BYT ban hành ngày 03/01/2013 về việc ban hành tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh Y học”
• Bộ Y tế, Giáo trình thực hành Vi sinh vật, NXB Y học, 2004.

IV. TRÁCH NHIỆM

• Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
• Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
• Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

V. ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

RT – PCR	Real Time Polymerase Chain Reaction
DNA	Deoxyribose Nucleic Acid
BP	Bệnh Phẩm
IC	Internal Control
RT – PCR	Real Time Polymerase Chain Reaction

VI. NGUYÊN LÝ

Dựa trên nguyên lý của kỹ thuật  Realtime PCR nhằm phát hiện và xác định serotype virus DENV 1, 2, 3, và 4 gây bệnh sốt xuất huyết Dengue.

   Đối chứng (IC) được bổ sung từ bước tách chiết để kiểm soát chất lượng của quá trình tách chiết RNA và PCR

   Tín hiệu được phát hiện trên 5 kênh màu

   + cDNA Dengue genotype 1 được phát hiện trên kênh FAM

   + cDNA Dengue genotype 2 được phát hiện trên kênh JOE/HEX

   + cDNA Dengue genotype 3 được phát hiện trên kênh ROX/Texas Red

   + cDNA Dengue genotype 4 được phát hiện trên kênh Cy5

   + IC được phát hiện trên kênh Cy5.5/Crimson/ Quasar705

           Độ nhạy: mẫu mô 1000 copies/ml; mẫu huyết thanh/huyết tương: 500 copies/ml

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

7.1. Trang thiết bị

- Máy ly tâm Centrifuge 5424R (Eppendorf)

- Máy ly tâm MF 80 ( Hanil)

- Tủ lạnh 2°C - 8°C

- Tủ âm sâu (-20°C)

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Tủ an toàn sinh học Esco PCR Cabinet

- Máy vortex

- Micropipettes 10µl, 100 µl, 1000 µl

- Máy ly tâm lắng mẫu nhanh cho tuve 0,2ml

- Máy tách chiết DNA – RNA tự động SaMag 12 – Sacase Biotechnology

- Máy SaCycler – 96 Real Time PCR System - Sacase Biotechnology

- Bộ lưu điện

7.2. Dụng cụ hóa chất, vật tư tiêu hao

- SaMag Viral Nucleic Acid Extraction Kit

- Khay đựng bệnh phẩm

- Hộp vận chuyển bệnh phẩm  

- Tube đựng bệnh phẩm  15ml, 50ml

- Đầu  côn  có  lọc  10µl , 100 µl, 1000 µl

- Effendorf  loại 1,5 ml vô trùng

- Giấy thấm 

- Giấy xét nghiệm 

- Sổ lưu kết quả xét nghiệm 

- Bút viết kính 

- Bút bi 

- Mũ 

- Khẩu trang 

- Găng không có bột

- Găng tay xử lý dụng cụ 

- Quần áo bảo hộ 

- Dung dịch nước rửa tay 

- Cồn sát trùng tay nhanh 

- Dung dịch khử trùng 

- Khăn lau tay 

- Dụng cụ để làm lạnh và giữ ống PCR

7.3. Mẫu bệnh phẩm

- Lấy mẫu bệnh phẩm theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.

- Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu.

VIII. NỘI DUNG

8.1. Lấy bệnh phẩm

            Cách lấy bệnh phẩm thực hiện theo quy trình lấy và vận chuyển bệnh phẩm mã số……..

8.2. Quy trình tách chiết RNA

8.2.1. Chuẩn bị

- Khởi động tủ an toàn sinh học theo quy trình hướng dẫn vận hành tủ an toàn sinh học mã số ……..

- Đánh số thứ tự các mẫu bệnh  phẩm;

- Ghi nhãn, dán và đánh dấu  lên ống effendorf  loại 1,5 ml để đựng huyết thanh

- Ly tâm ống đựng máu để tách huyết thanh thực hiện theo quy trình hướng dẫn sử dụng máy ly tâm mã số……

- Hút huyết thanh vào ống effendorf  loại 1,5 ml đã dán nhãn và ghi số thứ tự

8.2.2. Quy trình tách chiết RNA  bằng hệ thống tự động

            Tách chiết RNA thực hiện theo quy trình tách chiết DNA – RNA bằng hệ thống tự động mã số……

8.3.  Quy trình RT – PCR xác định genotype Dengue Virus

8.3.1. Khởi động máy RT – PCR và khai báo chương trình PCR

Khởi động máy RT – PCR thực hiện theo quy trình hướng dẫn vận hành máy RT-PCR mã số…….

- Lựa chọn màu FAM/ JOE (hoặc HEX)/ ROX/ CYS5/ CYS5.5 cho mẫu BP, chứng dương và chứng âm.

Bước 3: Cài đặt chương trình luân nhiệt và tích vào ô pulse

1 Chu kỳ	50oC - 30 phút
1 Chu kỳ	95oC - 15 phút
5 Chu kỳ	95oC - 10 giây
	56oC - 40 giây
	72oC - 20 giây
40 chu kỳ	95oC - 10 giây
	54oC - 40 giây + chụp hình
	72oC - 20 giây

 

8.3.2. Real-time PCR xác định Genotype Dengue virus

Bước 1: Chuẩn bị tủ vô trùng và các tube 0.2 ml đặt trên các giá lạnh

Bước 2: Đánh dấu các ký hiệu mẫu BP tương ứng lên các tube PCR: viết ký hiệu lên thành ống, tuyệt đối không viết lên nắp, vì máy chụp hình từ trên nắp ống.

Bước 3: Hút vào mỗi tube PCR

+ 10 µl PCR mix 1 FRT DV

+ 5 µl RT - PCR mix 2 TM

+ 0,5 µl Hotstart TaqF polymerase

+ 0,25 µl RT - G - mix2

+ 0,25 µl MMLX Revertase

Bước 4: Hút 10 µl chứng dương, chứng âm và dung dịch RNA mẫu BP vào các tube tương ứng). Thao tác mẫu nào, chỉ mở nắp ống PCR tương ứng, thực hiện xong đóng thật chặt nắp tube ngay để tránh lây nhiễm.

Bước 5: Ly tâm các ống PCR để dịch lắng xuống đáy ống và đặt vào PCR plate ở các vị trí tương ứng.

Bước 6: Dùng giấy thấm lau thật sạch nắp ống trước khi đậy nắp máy. Nếu nắp ống bẩn hoặc chứa nước sẽ gây ra tình trạng tín hiệu huỳnh quang nhiễu và kết quả real-time PCR không chính xác.

Bước 7: Bấm nút khởi động chạy chương trình trên phần mềm và lưu file vào máy tính.

 IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

Sau khi kết thúc real-time PCR, chuyển sang chế độ Analysis và phân tích kết quả theo các trình tự sau:

Bước 1: Kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm

   - Chọn chứng (-) phân tích trên 4 kênh màu FAM/HEX/ROX/CYS5

   - Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại với 4 kênh màu FAM/HEX/ROX/CYS5 mẫu không bị ngoại nhiễm. Vì vậy có thể đọc kết quả mẫu chứng (+) và mẫu BP.

   - Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với 4 kênh màu FAM/HEX/ROX/CYS5 mẫu bị ngoại nhiễm, phải tiến hành tách chiết RNA lại.

Bước 2: Kiểm tra độ nhạy

   - Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu CYS 5.5

   - Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu CYS 5.5: PCR không bị ức chế.

   - Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại hoặc tín hiệu thấp với kênh màu CYS 5.5, PCR bị ức chế toàn phần hay một phần, tách chiết RNA lại  hoặc pha loãng RNA trước khi chạy PCR.

Bước 3: Xác định mẫu dương tính Dengue

   - Chọn từng mẫu BP, chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên 4 kênh màu FAM/ HEX/ ROX/ CYS5

   - Mẫu BP có tín hiệu huỳnh quang dương tính với FAM và dương tính với màu CYS5.5  là những mẫu dương tính với Dengue type 1

   - Mẫu BP có tín hiệu huỳnh quang dương tính với JOE/HEX và dương tính với màu CYS5.5 là những mẫu dương tính với Dengue type 2

   - Mẫu BP có tín hiệu huỳnh quang dương tính với ROX và dương tính với màu CYS5.5 là những mẫu dương tính với Dengue type 3

   - Mẫu BP có tín hiệu huỳnh quang dương tính với CYS 5 và dương tính với màu CYS5.5  là những mẫu dương tính với Dengue type 4

Bước 4: Xác định mẫu BP âm tính Dengue

- Chọn từng mẫu BP + chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM/ HEX/ ROX/ CYS5/ CYS5.5

- Mẫu BP không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và dương tính với màu CYS5.5, thì kết quả là mẫu BP âm tính với Dengue type 1.

- Mẫu BP không có tín hiệu khuyếch đại với màu JOE/HEX và dương tính với màu CYS5.5, thì kết quả là mẫu BP âm tính với Dengue type 2.

- Mẫu BP không có tín hiệu khuyếch đại với màu ROX và dương tính với màu CYS5.5, thì kết quả là mẫu BP âm tính với Dengue type 3.

- Mẫu BP không có tín hiệu khuyếch đại với màu CYS5 và dương tính với màu CYS5.5, thì kết quả là mẫu BP âm tính với Dengue type 4.

- Nếu mẫu BP không có tín hiệu khuyếch đại với 4 màu FAM/ HEX/ ROX/ CYS5 và âm tính với màu CYS5.5, thì mẫu BP bị ức chế cần tiến hành lại PCR với RNA đã pha loãng hoặc tách chiết lại. Nếu kết quả vẫn như cũ thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm.

 X. LƯU Ý

10.1. Sai sót

Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả, thông thường do:

- Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn

- Chứng âm và những mẫu bệnh phẩm âm tính bị nhiễm chéo bởi huyết thanh/huyết tương có nồng độ kháng thể cao

- Dung dịch cơ chất bị nhiễm bởi các tác nhân oxy hóa (thuốc tẩy, ion kim loại…)

10.2. Xử trí

- Tuân thủ đúng các quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm

- Kiểm tra và vệ sinh máy thường xuyên trước và sau khi làm xét nghiệm

- Tuân thủ đúng quy trình xét nghiệm

XI. HỒ SƠ LƯU

• Lưu trữ các biểu mẫu phiếu QC theo đúng quy định của khoa.

XII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

Tên tài liệu	Mã tài liệu
Quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm
Sổ tay hướng dẫn lấy mẫu bệnh phẩm
Quy trình an toàn phòng xét nghiệm
Hướng dẫn sử dụng kit real-time PCR xác định genotype Dengue