VS.QTKT.SHPT.03 HCV ĐO TẢI LƯỢNG HỆ THỐNG TỰ ĐỘNG
(Cập nhật: 6/7/2020)
VS.QTKT.SHPT.03 HCV ĐO TẢI LƯỢNG HỆ THỐNG TỰ ĐỘNG
I. MỤC ĐÍCH
Đếm số lượng bản copies của HCV RNA trong một đơn vị thể tích (ml) huyết tương hoặc huyết thanh bằng hệ thống tự động.
II. PHẠM VI ÁP DỤNG
Áp dụng tại Khoa xét nghiệm Vi sinh - Bệnh viện đa khoa Tỉnh Quảng Ninh.
III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN
- Quyết định 26/QĐ-BYT ban hành ngày 03/01/2013 về việc ban hành tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh Y học”
- Bộ Y tế, Giáo trình thực hành Vi sinh vật, NXB Y học, 2004.
IV. TRÁCH NHIỆM
- Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
- Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình
V. ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT
RT – PCR |
Real Time Polymerase Chain Reaction |
RNA |
Ribonucleotit Nucleic Acid |
BP |
Bệnh Phẩm |
IC |
Internal Control |
HCV |
Hepatitis C Virus |
RT – PCR |
Real Time Polymerase Chain Reaction |
VI. NGUYÊN LÝ
HCV đo tải lượng hệ thống tự động là xét nghiệm Kit phát hiện và định lượng nồng độ virus Hepatitis C trong 1ml huyết tương người bằng kỹ thuật kỹ thuật One step Real-time PCR. Mồi và probe được thiết kế trong vùng 5’UTR có tính bảo tồn cao của bộ gene HCV và khuếch đại một trình tự có kích thước 244 bp. Kỹ thuật cho phép định lượng HCV-RNA của cả 7 kiểu gen khác nhau của virus HCV. Đối chứng (IC) được bổ sung từ bước tách chiết để kiểm soát chất lượng của quá trình tách chiết RNA và PCR.
RNA HCV được phát hiện trong kênh HEX, IC được phát hiện trên kênh FAM.
VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ
7.1. Trang thiết bị
- Máy ly tâm Centrifuge 5424R (Eppendorf)
- Máy ly tâm MF 80 ( Hanil)
- Tủ lạnh 2°C - 8°C
- Tủ âm sâu (-20°C)
- Tủ an toàn sinh học cấp 2
- Tủ an toàn sinh học Esco PCR Cabinet
- Máy vortex
- Micropipettes 10µl, 100 µl, 1000 µl
- Máy ly tâm lắng mẫu nhanh cho tuve 0,2ml
- Máy tách chiết DNA – RNA tự động SaMag 12 – Sacase Biotechnology
- Máy SaCycler – 96 Real Time PCR System - Sacase Biotechnology
- Bộ lưu điện
7.2. Dụng cụ hóa chất, vật tư tiêu hao
- SaMag Viral Nucleic Acid Extraction Kit
- Kít định lượng virus HBV Real-TM (HBV Real-TM Quant Dx): Đạt tiêu chuẩn ISO 9001:2008 & 13485:2012.
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh phẩm
- Tube đựng bệnh phẩm 15ml, 50ml
- Đầu côn có lọc 10µl , 100 µl, 1000 µl
- Effendorf loại 1,5 ml vô trùng
- Giấy thấm
- Giấy xét nghiệm
- Sổ lưu kết quả xét nghiệm
- Bút viết kính
- Bút bi
- Mũ
- Khẩu trang
- Găng không có bột
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bảo hộ
- Dung dịch nước rửa tay
- Cồn sát trùng tay nhanh
- Dung dịch khử trùng
- Khăn lau tay
- Dụng cụ để làm lạnh và giữ ống PCR
7.3. Mẫu bệnh phẩm
- Máu toàn phần hoặc Huyết thanh được đựng trọng ống không có chất chống đông.
- Lấy mẫu bệnh phẩm theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.
- Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu.
VIII. NỘI DUNG
8.1. Chuẩn bị
- Khởi động tủ an toàn sinh học thực hiện theo quy trình vận hành tủ an toàn sinh học mã số….
- Khởi động máy tách chiết DNA – RNA thực hiện theo quy trình vận hành máy tách chiết DNA – RNA tự động mã số …….
- Đánh số thứ tự các mẫu bệnh phẩm; ghi nhãn; dán và đánh dấu lên ống effendorf loại 1,5 ml để đựng huyết thanh
- Ly tâm ống máu để tách huyết thanh thực hiện theo quy trình vận hành máy ly tâm mã số ……
- Sử dụng pipette để hút huyết thanh vào ống effendorf loại 1,5 ml đã dán nhãn và ghi số thứ tự. Sử dụng pipette theo quy trình hướng dẫn sử dụng pipette mã số…..
8.2. Quy trình tách chiết DNA bằng hệ thống tự động
8.2.1. Pha stock
1. Cho Negative control (CONTRO -) vào các ống theo bảng sau:
Controls |
CONTROL -, µl |
CAL 1 |
1200 |
CAL 2 |
1200 |
CONTROL 1 |
1200 |
CONTROL 2 |
1200 |
CONTROL INT |
300 |
2. Đậy nắp và để ở nhiệt độ phòng 2 phút, vortex đều.
3. Ly tâm 5 giây
4. Bảo quản ở nhiệt độ 2-80C, bảo quản tránh ánh nắng trong 30 ngày.
8.2.2. Chuẩn bị mẫu
1. Chuẩn bị 3 mẫu CAL1, 3 mẫu CAL2 cho mỗi lần chạy đường chuẩn.
2. Chuẩn bị mẫu chứng dương và mẫu chứng âm.
3. Chuẩn bị mẫu BP
4. Bổ sung 10 µl CONTROL INT vào mỗi ống
8.2.3. Quy trình tách chiết HCV bằng hệ thống tự động
1. Sắp xếp các protocol vào máy theo thứ tự có sẵn
2. Hút 10µl RNA carier vào ống đựng bệnh phẩm, CAL1 và CAL2, chứng dương và chứng âm
3. Cho 200µl huyết thanh mẫu, CAL1 và CAL2, chứng dương và chứng âm vào ống có chứa hỗn hợp RNA carier
4. Tách chiết DNA thực hiện theo quy trình tách chiết DNA – RNA bằng hệ thống tự động mã số ……
8.3. Khởi động máy và khai báo chương trình chạy.
Bước 1: Khởi động máy:
- Bật máy real-time PCR ít nhất 20 phút trước khi chạy chương trình, tín hiệu đèn màu xanh hiển thị khởi động máy thành công.
- Mở chương trình phần mềm ở máy tính
- Kiểm tra kết nối giữa máy tính và real – time PCR: nút màu xan là kết nối thành công.
Bước 2: Khai báo trên PCR plate
- Xác định vị trí đặt ống PCR
- Chọn unkown cho, mẫu BP, chứng âm, chứng dương: khai báo tên hoặc số tương ứng với mẫu.
- Lựa chọn màu FAM, HEX cho 3 mẫu CAL1, 3CAL2,mẫu BP, chứng âm, chứng dương. Trong đó HEX phát hiện HCV và FAM phát hiện chứng nội tại.
- Khai báo các thông số khác: Thể tích chạy mẫu 50 µl, kỹ thuật gắn chất phát quang là Tagman và dạng ống PCR là 0,2ml corning tube.
Bước 3: Cài đặt chương trình chạy và tích vào ô pulse.
Stage |
Temp, oC |
Time |
Flourescense detection |
Cycle repeat |
Hold |
50 |
15 min |
- |
1 |
Hold |
95 |
15 min |
- |
1 |
Cycling |
95 |
5s |
- |
5 |
60 |
20s |
- |
||
72 |
15s |
- |
||
Cycling |
95 |
5s |
- |
40 |
60 |
30s |
FAM, JOE/HEX/Cy3 |
||
72 |
15s |
|
8.4. Chạy Real Time PCR định lượng HCV
Bước 1. Chuẩn bị tủ vô trùng và đặt các kit 0,2ml có chứa master mix HCV, đặt ống trên giá lạnh.
Bước 2. Ly tâm các tube chứa master mix để hóa chất lắng xuống đáy ống.
Bước 3. Đánh dấu các ký hiệu mẫu BP tương ứng lên các tube PCR. Viết ký hiệu lên thành ống, tuyệt đối không viết ký hiệu lên nắp ống vì máy đọc tín hiệu huỳnh quang từ nắp trên nắp.
Bước 4. Hút 50 µl CAL1, CAL2, RNA mẫu, chứng âm và chứng dương vào các ống PCR tương ứng. Thao tác mẫu nào chỉ mở nắp ống PCR tương ứng, thực hiện xong đóng chặt nắp tube lại để tránh lây nhiễm
Lưu ý: Trộn đều DNA BP trước khi hút, với RNA BP bảo quản -200C phải để tan đá và trộn đều,
Bước 5. Ly tâm các ống PCR để toàn bộ dịch lắng xuống đáy ống và đặt vào PCR plate ở các vị trí tương ứng.
Bước 6. Dùng giấy thấm sạch nắp ống trước khi đậy nắp máu. Nếu nắp ống bẩn hoặc chứa nước sẽ gây nhiễu tín hiệu huỳnh quang và kết quả RT-PCR sẽ không chính xác.
Bước 7. Ấn nút Play để chạy chương trình trên phần mềm và lưu file chạt vào máy tính.
8.5. Đọc kết quả
Sau khi kết thúc quá trình RT-PCR, chuyển sang chế độ Analysis và dựa vào đường chuẩn để phân tích
8.5.1. Xây dựng đường chuẩn
Dựa vào nồng độ của 3 mẫu CAL1 và 3 mẫu CAL2 để xây dựng đường chuẩn. Đường chuẩn bao gồm 2 điểm chuẩn, mỗi điểm lặp lại 3 lần với nồng độ khác nhau cho từng lot sản phẩm giúp kiểm soát kết quả định lượng, chỉ cần chạy 1 đường chuẩn HCV (Standard) cho mỗi lot sản xuất
Giới hạn định lượng (LOD): 13 - 100,000,000 IU/ml (52 - 400,000,000 copies/ml).
IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ
Sau khi kết thúc real-time PCR, chuyển sang chế độ Analysis và phân tích kết quả theo các trình tự sau:
Bước 1: phân tích chứng âm va chứng dương, lựa chọn các giếng chứng âm và chứng dương, chọn lần lượt màu HEX và FAM để phân tích. Mẫu chứng âm và chứng dương đạt yêu cầu nếu:
Chứng dương có tín hiệu huỳnh quang màu HEX tuyến tính vượt quá tín hiệu nền và có FAM dương tính.
Chứng âm có tín hiệu huỳnh quang màu HEX âm tính và có FAM dương tính.
Bước 2: Phân tích mẫu BP, chọn các mẫu BP và lựa chọn màu HEX, chia các nhóm đường biểu diễn có các tín hiệu huỳnh quang như sau:
Nhóm 1: Mẫu dương tính mạnh có đường biểu diễn chuẩn
Nhóm 2: Mẫu dương tính mạnh có đường biểu diễn chuẩn
Nhóm 3: Mẫu âm tính
Nhóm 4: Mẫu nhiễu có đường biểu diễn không chuẩn
Bước 3: Phân tích mẫu nhóm 1 và nhóm 2
Chọn các CAL1, CAL2, chứng âm và các mẫu thuộc nhóm 1 và nhóm 2, kéo baseline càng sát đường biểu diễn của chứng âm càng tốt, đồng thời cao hơn tín hiệu nhiễu cao nhất và các thông số của đường chuẩn phải đạt yêu cầu.
Tiến hành lấy kết quả ở trên cửa sổ bên trái để xác định nồng độ của mẫu BP. Kit định lượng HCV có thể phát hiện nồng độ RNA-HBV trong huyết thanh bệnh nhân từ 52 - 400,000,000 copies/ml.
Bước 4: Phân tích mẫu nhóm 3.
Chọn các giếng của mâu âm, chọn màu HEX sau đó đến màu FAM. Những mẫu âm tính với màu HEX và dương tính với màu FAM, kết luận mẫu âm tính với HCV.
Những mẫu âm tính với cả màu FAM và màu HEX là mẫu âm tính giả, cần tách chiết lại RNA hoặc pha loãng RNA và tiến hành RT-PCR lại.
Bước 5. Phân tích mẫu nhóm 4
Chọn những mẫu có tín hiệu huỳnh quang bất thường, chọn màu FAM và HEX, kiểm tra ở chế độ dữ liệu thô (monitoring).
Nếu có đường biểu diễn âm tính với màu HEX và dương tính với màu FAM, kết luận mẫu âm tính.
Những mẫu có tín hiệu dương tính nhiễu trước chu kỳ 05 là dương tính giả.
Nếu đường biểu diễn dương tính với màu HEX, chọn những mẫu này, standard và chứng âm. Thay đổi giá trị trên trục y để phóng đại tín hiệu huỳnh quang, đưa về chế độ Analysis, kéo đường baseline về sát tín hiệu nhiễu cao nhất và đọc kết quả.
X. LƯU Ý
10.1. Sai sót
Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả, thông thường do:
- Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn
- Chứng âm và những mẫu bệnh phẩm âm tính bị nhiễm chéo bởi huyết thanh/huyết tương có nồng độ kháng thể cao
- Dung dịch cơ chất bị nhiễm bởi các tác nhân oxy hóa (thuốc tẩy, ion kim loại…)
10.2. Xử trí
- Tuân thủ đúng các quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm
- Kiểm tra và vệ sinh máy thường xuyên trước và sau khi làm xét nghiệm
- Tuân thủ đúng quy trình xét nghiệm
XI. HỒ SƠ LƯU
- Lưu trữ các biểu mẫu phiếu QC theo đúng quy định của khoa.
XII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN
Tên tài liệu |
Mã tài liệu |
Quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm |
|
Sổ tay hướng dẫn lấy mẫu bệnh phẩm |
|
Quy trình an toàn phòng xét nghiệm |
|
Hướng dẫn sử dụng kit real-time PCR định lượng HCV |
|
(Lượt đọc: 3405)
Tin tức liên quan
- VS.QTKT.SHPT.02 HBV ĐO TẢI LƯỢNG HỆ THỐNG TỰ ĐỘNG
- VS.QTKT.SHPT.01 MYCOBACTERIUM TUBERTULOSIS
- VS.QTKT.NC.30.QUY TRÌNH CẤY KIỂM TRA PHÁT HIỆN KHÁNG THUỐC - NGƯỜI MANG
- VS.QTKT.NC.29.QUY TRÌNH CẤY KIỂM TRA NƯỚC
- VS.QTKT.NC.28.QUY TRÌNH CẤY KIỂM TRA NƯỚC THẢI SINH HOẠT
- VS.QTKT.NC.27.QUY TRÌNH CẤY KIỂM TRA BỀ MẶT
- VS.QTKT.NC.26.QUY TRÌNH CẤY KIỂM TR DỤNG CỤ ĐÃ TIỆT TRÙNG
- VS.QTKT.NC.25.QUY TRÌNH KIỂM TRA BÀN TAY
- VS.QTKT.NC.24.QUY TRÌNH KIỂM TRA KHÔNG KHÍ
- VS.QTKT.NC.23.QUY TRÌNH BẢO QUẢN CỦNG CHUẨN
- Tiêu điểm
- Tin đọc nhiều