I. MỤC ĐÍCH

Quy định thống nhất các bước tiến hành realtime – PCR định tính và lai DNA định genotype HPV.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

Áp dụng tại Khoa xét nghiệm Vi sinh - Bệnh viện đa khoa Tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• Quyết định 26/QĐ-BYT ban hành ngày 03/01/2013 về việc ban hành tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh Y học”
• Bộ Y tế, Giáo trình thực hành Vi sinh vật, NXB Y học, 2004.

IV. TRÁCH NHIỆM

• Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
• Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
• Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

V. ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

RT – PCR	Real Time Polymerase Chain Reaction
DNA	Deoxyribose Nucleic Acid
BP	Bệnh Phẩm
IC	Internal Control
HPV	Human papiloma virus
RT – PCR	Real Time Polymerase Chain Reaction

VI. NGUYÊN LÝ

Virus u nhú người (human papilloma virus – HPV) gây những tổn thương tăng sinh của biểu mô vảy bao gồm u nhú (mụn cơm) thông thường, u nhu phẳng, u nhú gan bàn chân, u nhú hậu môn – sinh dục, bệnh u nhú thanh quản. Nhiễm HP cũng góp phần vào sự phát sinh loạn sản biểu mô vảy và ung thư biểu mô vảy sinh dục.

   HPV là những virus DNA kép, chúng là thành phần của nhóm papovavirus. Trên 60 type khác nhau của hPV đã được xác định và những type khác nhau kết hợp với những tổn thương khác nhau. Những type 1,2 và 4 của HPV gây u nhú thông thường và u nhú gan bàn chân. Những u nhú 6,10,11 và 40 đến 45 gây u nhú hậu môn sinh dục. Những type 16,28.31 kết hợp với ung thư biểu mô vảy đường sinh dục.

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

7.1. Trang thiết bị

- Máy ly tâm Centrifuge 5424R (Eppendorf)

- Máy ly tâm MF 80 ( Hanil)

- Tủ lạnh 2°C - 8°C

- Tủ âm sâu (-20°C)

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Tủ an toàn sinh học Esco PCR Cabinet

- Máy vortex

- Micropipettes 10µl, 100 µl, 1000 µl

- Máy ly tâm lắng mẫu nhanh cho tuve 0,2ml

- Máy tách chiết DNA – RNA tự động SaMag 12 – Sacase Biotechnology

- Máy SaCycler – 96 Real Time PCR System - Sacase Biotechnology

- Bộ lưu điện

7.2. Dụng cụ hóa chất, vật tư tiêu hao

- SaMag Viral Nucleic Acid Extraction Kit

- Khay đựng bệnh phẩm

- Hộp vận chuyển bệnh phẩm  

- Tube đựng bệnh phẩm  15ml, 50ml

- Đầu  côn  có  lọc  10µl , 100 µl, 1000 µl

- Effendorf  loại 1,5 ml vô trùng

- Giấy thấm 

- Giấy xét nghiệm 

- Sổ lưu kết quả xét nghiệm 

- Bút viết kính 

- Bút bi 

- Mũ 

- Khẩu trang 

- Găng không có bột

- Găng tay xử lý dụng cụ 

- Quần áo bảo hộ 

- Dung dịch nước rửa tay 

- Cồn sát trùng tay nhanh 

- Dung dịch khử trùng 

- Khăn lau tay 

- Dụng cụ để làm lạnh và giữ ống PCR

7.3. Mẫu bệnh phẩm

- Lấy mẫu bệnh phẩm theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.

- Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu.

VIII. NỘI DUNG

8.1. Quy trình tách chiết DNA

8.1.1. Chuẩn bị

- Khởi động tủ an toàn sinh học, máy tách chiết DNA – RNA tự động ít nhất 15 phút trước khi thực hiện

   - Sắp xếp các dụng cụ cần thiết vào tủ an toàn sinh học

   - Đánh số thứ tự các mẫu bệnh  phẩm;

- Ghi nhãn, dán và đánh dấu  lên ống effendorf  loại 1,5 ml để đựng BP

- Đối với BP là dịch được quyệt bằng tăm bông vô trùng: Bẻ đầu tăm bông chứa BP vào ống effendorf 1,5ml, bổ sung 500 µl dung dịch TE 1X, sau đó vortex đều.

- Đối với BP là mảnh sinh thiết hoặc vẩy da: Cho BP vào ống effendorf, bổ sung dung dịch TE 1X, dùng chày vô trùng nghiền nhỏ, sau đó bổ sung thêm dung dịch TE 1X cho đủ 500 µl, rồi tiến hành vortex.

8.1.2. Quy trình tách chiết DNA bằng hệ thống tự động

1. Sắp xếp các protocol vào máy theo thứ tự có sẵn

2. Hút 10µl RNA carier  vào ống đựng bệnh phẩm

4. Cho 200µl BP vào ống có chứa hỗn hợp RNA carier và IC

5. Chọn protocol barcode

6. Chọn Sample volume

7. Chọn elution tube type và elution volume

8. Chọn Run để tiến hành tách chiết DNA

9. DNA sau khi được tách chiết phải được bảo quản ở tủ đá có nhiệt độ -20⁰ C

8.3.  Quy trình RT – PCR định tính HPV

8.3.1. Khởi động máy và khai báo chương trình PCR

Bước 1: Khởi động máy

- Bật máy real-time PCR ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình, tín hiệu xanh là báo hiệu khởi động máy thành công.

- Bật máy tính và mở chương trình phần mềm

- Kiểm tra kết nối giữa máy tính và máy real-time PCR: nút play màu xanh là kết nối thành công

Bước 2: Khai báo trên PCR plate

            - Xác định vị trí đặt ống PCR

            - Chọn unknown cho mẫu BP, chứng âm và chứng dương, khai báo tên hoặc số tương ứng với mẫu.

            - Lựa chọn màu FAM + HEX cho mẫu BP, chứng dương và chứng âm. Trong đó, FAM phát hiện HPV và HEX phát hiện chứng nội tại.

            - Khai báo các thông số khác: Thể tích chạy mẫu là 25µl, kỹ thuật gắn chất phát quang là Tagman và dạng ống PCR - 0.2 ml corning tube.

Bước 3: Cài đặt chương trình luân nhiệt và tích vào ô pulse

1 Chu kỳ	95oC - 5 phút
40 chu kỳ	95oC - 15 giây
	55oC - 60 giây + chụp hình
	72oC - 20 giây

8.3.2. Real-time PCR xác định HPV

Bước 1: Chuẩn bị tủ vô trùng và các tube 0.2 ml đặt trên các giá lạnh

Bước 2: Đánh dấu các ký hiệu mẫu BP tương ứng lên các tube PCR: viết ký hiệu lên thành ống, tuyệt đối không viết lên nắp, vì máy chụp hình từ trên nắp ống.

Bước 3: Ly tâm ống PCR chứa hỗn hợp master mix

Bước 4: Hút 5 µl chứng dương, chứng âm và dung dịch DNA mẫu BP vào các tube tương ứng. Thao tác mẫu nào, chỉ mở nắp ống PCR tương ứng, thực hiện xong đóng thật chặt nắp tube ngay để tránh lây nhiễm.

Bước 5: Ly tâm các ống PCR để dịch lắng xuống đáy ống và đặt vào PCR plate ở các vị trí tương ứng.

Bước 6: Dùng giấy thấm lau thật sạch nắp ống trước khi đậy nắp máy. Nếu nắp ống bẩn hoặc chứa nước sẽ gây ra tình trạng tín hiệu huỳnh quang nhiễu và kết quả real-time PCR không chính xác.

Bước 7: Bấm nút khởi động chạy chương trình trên phần mềm và lưu file vào máy tính.

 IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

Sau khi kết thúc real-time PCR, chuyển sang chế độ Analysis và phân tích kết quả theo các trình tự sau:

Bước 1: Kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm

            - Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

            - Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu không bị ngoại nhiễm. Vì vậy có thể đọc kết quả mẫu chứng (+) và mẫu BP.

            - Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu bị ngoại nhiễm, phải tiến hành tách chiết DNA lại.

Bước 2: Kiểm tra độ nhạy

            - Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

            - Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu HEX: PCR không bị ức chế.

            - Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại hoặc tín hiệu thấp với kênh màu HEX, PCR bị ức chế toàn phần hay một phần, tách chiết DNA lại  hoặc pha loãng DNA trước khi chạy PCR.

Bước 3: Kiểm tra độ nhạy của master mix

            - Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

            - Đọc kết quả Ct của chứng (+), số copy 100 - Ct = 30 - <33.36 là khoảng chấp nhận được.

Bước 4: Xác định type HPV

            - Chọn từng mẫu BP + chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM

            - Mẫu BP có tín hiệu huỳnh quang với kênh màu FAM và có Ct <36 là những mẫu dương tính HPV

            - Mẫu BP có tín hiệu huỳnh quang dương tính rõ ràng và Ct ≥36 thì kết luận là mẫu dương tính dưới ngưỡng phát hiện.

            - Mẫu BP có tín hiệu huỳnh quang dương tính không rõ ràng và Ct≥36 thì kết luận là mẫu nghi ngờ và đề nghị lấy mẫu lại để xét nghiệm hoặc xét nghiệm sau 1-3 tháng.

            - Lưu ý: Với những mẫu dương tính yếu (Ct>30) phải chạy thêm 1 phản ứng real-time PCR nữa để đủ DNA cho buowcs định type HPV

Bước 5: Xác định mẫu BP âm tính HPV

- Chọn từng mẫu BP + chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Mẫu BP không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và dương tính với màu HEX, thì kết quả là mẫu BP âm tính với HPV

- Nếu mẫu BP không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và âm tính với màu HEX, thì mẫu BP bị ức chế cần tiến hành lại PCR với DNA đã pha loãng hoặc tách chiết lại. Nếu kết quả vẫn như cũ thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm.

9.2 Định genotype HPV

9.2.1. Cách thực hiện

            - Trộn đều các dung dịch hóa chất trước khi sử dụng, đánh dấu các hộp chứa màng lai tương ứng với ký hiệu BP.

            - Hút 50µl dung dịch DB1 vào tube chứa sản phẩm PCR, trộn đều thật kỹ bằng Pipette hoặc vortex, để yên 30  phút ở nhiệt độ phòng.

Lưu ý: Nếu không trộn đều, xét nghiệm sẽ không thành công

            - Chuẩn bị dung dịch DB^: 2,5ml DB2 + 22,25ml nước cất + 0,25 ml DB3. Sau đó hút 1,8ml DB6 vào hộp chứa màng lai

            - Hút 100µl DB6 vào tube 0,2ml chứa dung dịch DB4, trộn đều và cho tất cả cùng với sản phẩm PCR trong DB1 vào hộp chứa màng lai, trộn đều ủ 3-4h ở 40⁰C, lắc ở tốc độ vừa phải để dung dịch không tràn ra ngoài.

Lưu ý: Cho dung dịch DB4 sau khi hòa với dung dịch DB6 vào trước, trộn đều sau đó mới cho sản phẩm PCR trong dung dịch DB1, không trộn hai dung dịch với nhau trước khi cho vào hộp màng lai.

       - Loại từ từ dung dịch trong hộp tránh để mang lai rơi ra ngoài. Bổ sung 5ml dung dịch DB6, lắc rửa 30 giây ở nhiệt độ phòng và rửa lặp lại 3 lần.

       - Loại dung dịch rửa, sau đó thêm 1,5ml dung dịch DB5, ủ 15-45 phút ở 37⁰C trong điều kiện tối, không lắc. Không được để đầu tip dùng hút dung dịch DB5 chạm vào hộp hoặc màng lai.

       - Loại dung dịch trong hộp và rửa màng lai với 5ml nước cất.

       - Loại bỏ hết nước cất và đọc kết quả.

9.2.2. Đọc kết quả

       - So sánh vị trí xuất hiện hình tròn màu xanh, tín hiệu tròn màu xanh xuất hiện tại vị trí nào trên màng lai thì mẫu dương  tính tại vị trí đó. Mẫu Bp có thể có tín hiệu với nhiều vị trí khác nhau trên màng lai.

       - Tín hiệu tròn màu xanh dương tính có thể xanh đậm hoặc nhạt tương ứng với lượng DNA sản phẩm PCR, những vệt xanh không đặc hiệu thường nằm ngoài các vị trí và thường chỉ thấy ở mặt trên của màng lai.

       - Bảo quản màng lai ở 2-8⁰C trong vài ngày không bị mất tín hiệu dương tính.

X. LƯU Ý

10.1. Sai sót

Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả, thông thường do:

- Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn

- Chứng âm và những mẫu bệnh phẩm âm tính bị nhiễm chéo bởi huyết thanh/huyết tương có nồng độ kháng thể cao

- Dung dịch cơ chất bị nhiễm bởi các tác nhân oxy hóa (thuốc tẩy, ion kim loại…)

10.2. Xử trí

- Tuân thủ đúng các quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm

- Kiểm tra và vệ sinh máy thường xuyên trước và sau khi làm xét nghiệm

- Tuân thủ đúng quy trình xét nghiệm

XI. HỒ SƠ LƯU

• Lưu trữ các biểu mẫu phiếu QC theo đúng quy định của khoa.

XII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

Tên tài liệu	Mã tài liệu
Quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm
Sổ tay hướng dẫn lấy mẫu bệnh phẩm	VS.STLM
Sổ tay an toàn phòng xét nghiệm
Hướng dẫn sử dụng kit real-time PCR định TYPE HPV