VS.QTKT.SHPT.09 XÁC ĐỊNH GENOTYPE HCV
(Cập nhật: 6/7/2020)
VS.QTKT.SHPT.09 XÁC ĐỊNH GENOTYPE HCV
I. MỤC ĐÍCH
Xác định genotype HCV trong huyết tương hoặc huyết thanh bằng hệ thống tự động.
II. PHẠM VI ÁP DỤNG
Áp dụng tại Khoa xét nghiệm Vi sinh - Bệnh viện đa khoa Tỉnh Quảng Ninh.
III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN
- Quyết định 26/QĐ-BYT ban hành ngày 03/01/2013 về việc ban hành tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh Y học”
- Bộ Y tế, Giáo trình thực hành Vi sinh vật, NXB Y học, 2004.
IV. TRÁCH NHIỆM
- Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
- Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình
V. ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT
RT – PCR |
Real Time Polymerase Chain Reaction |
RNA |
Ribonucleotit Nucleic Acid |
BP |
Bệnh Phẩm |
IC |
Internal Control |
HCV |
Hepatitis C Virus |
RT – PCR |
Real Time Polymerase Chain Reaction |
VI. NGUYÊN LÝ
Xét nghiệm real-time PCR định genotype HCV bằng hệ thống tự động nhằm phát hiện và xác định các genotype (1a, 1b, 2, 3, 4, 5a, 6) của virus HCV trong các mẫu lâm sàng bằng phương pháp Realtime PCR.
Đối chứng nội (IC) được bổ sung từ bước tách chiết để kiểm soát chất lượng của quá trình tách chiết RNA và PCR.
Mỗi mẫu được thực hiện phản ứng Real-time PCR trên 4 ống và các genotype được xác định trên các kênh màu:
- Ống PCR 1b/3:
+ cDNA HCV genotype 1b được phát hiện trên kênh FAM
+ cDNA HCV genotype 3 được phát hiện trong kênh HEX
- Ống PCR 1a/2
+ cDNA HCV genotype 1a được phát hiện trên kênh FAM
+ cDNA HCV genotype 2 được phát hiện trên kênh HEX
- Ống PCR 4/IC
+ cDNA HCV genotype 4 được phát hiện trên kênh FAM
+ IC được phát hiện trong kênh HEX
- Ống PCR 5a/6
+ cDNA HCV genotype 5a được phát hiện trên kênh FAM
+ cDNA HCV genotype 6 được phát hiện trên kênh HEX
Độ nhạy của phản ứng: 1000 IU/ml
VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ
7.1. Trang thiết bị
- Máy ly tâm Centrifuge 5424R (Eppendorf)
- Máy ly tâm MF 80 ( Hanil)
- Tủ lạnh 2°C - 8°C
- Tủ âm sâu (-20°C)
- Tủ an toàn sinh học cấp 2
- Tủ an toàn sinh học Esco PCR Cabinet
- Máy vortex
- Micropipettes 10µl, 100 µl, 1000 µl
- Máy ly tâm lắng mẫu nhanh cho tuve 0,2ml
- Máy tách chiết DNA – RNA tự động SaMag 12 – Sacase Biotechnology
- Máy SaCycler – 96 Real Time PCR System - Sacase Biotechnology
- Bộ lưu điện
7.2. Dụng cụ hóa chất, vật tư tiêu hao
- SaMag Viral Nucleic Acid Extraction Kit
- Kít định lượng virus HBV Real-TM (HBV Real-TM Quant Dx): Đạt tiêu chuẩn ISO 9001:2008 & 13485:2012.
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh phẩm
- Tube đựng bệnh phẩm 15ml, 50ml
- Đầu côn có lọc 10µl , 100 µl, 1000 µl
- Effendorf loại 1,5 ml vô trùng
- Giấy thấm
- Giấy xét nghiệm
- Sổ lưu kết quả xét nghiệm
- Bút viết kính
- Bút bi
- Mũ
- Khẩu trang
- Găng không có bột
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bảo hộ
- Dung dịch nước rửa tay
- Cồn sát trùng tay nhanh
- Dung dịch khử trùng
- Khăn lau tay
- Dụng cụ để làm lạnh và giữ ống PCR
7.3. Mẫu bệnh phẩm
- Máu toàn phần hoặc Huyết thanh được đựng trọng ống không có chất chống đông.
- Lấy mẫu bệnh phẩm theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.
- Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu.
VIII. NỘI DUNG
8.1.1. Chuẩn bị
- Khởi động tủ an toàn sinh học, máy tách chiết DNA – RNA tự động ít nhất 15 phút trước khi thực hiện
- Sắp xếp các dụng cụ cần thiết vào tủ an toàn sinh học
- Đánh số thứ tự các mẫu bệnh phẩm;
- Ghi nhãn, dán và đánh dấu lên ống effendorf loại 1,5 ml để đựng huyết thanh
- Ly tâm ống đựng máu để tách huyết thanh (tốc độ 15000 vòng/ 15 phút)
- Hút huyết thanh vào ống effendorf loại 1,5 ml đã dán nhãn và ghi số thứ tự
8.2. Quy trình tách chiết RNA bằng hệ thống tự động
1. Sắp xếp các protocol vào máy theo thứ tự có sẵn
2. Hút 10µl RNA carier vào ống đựng bệnh phẩm
3. Hút tiếp 10µl IC vào ống chứa RNA carier
4. Cho 200µl huyết thanh mẫu vào ống có chứa hỗn hợp RNA carier và IC
5. Chọn protocol barcode
6. Chọn Sample volume
7. Chọn elution tube type và elution volume
8. Chọn Run để tiến hành tách chiết RNA
9. RNA sau khi được tách chiết phải được bảo quản ở tủ đá có nhiệt độ -200 C
8.3. Quy trình RT – PCR xác định genotype HCV
8.3.1. Khởi động máy và khai báo chương trình PCR
Bước 1: Khởi động máy
- Bật máy real-time PCR ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình, tín hiệu xanh là báo hiệu khởi động máy thành công.
- Bật máy tính và mở chương trình phần mềm
- Kiểm tra kết nối giữa máy tính và máy real-time PCR: nút play màu xanh là kết nối thành công
Bước 2: Khai báo trên PCR plate
- Xác định vị trí đặt ống PCR
- Chọn unknown cho 1b/3a; 1a/2; 4/IC và 5/6, khai báo tên hoặc số tương ứng với mẫu.
- Lựa chọn màu FAM + HEX
- Khai báo các thông số khác: Thể tích chạy mẫu là 25µl, kỹ thuật gắn chất phát quang là Tagman và dạng ống PCR - 0.2 ml corning tube.
8.3.2. Thực hiện phản ứng sao chép ngược
Trước khi tiến hành định genotype HCV cần thực hiện phản ứng sao chép ngược để tổng hợp cDNA từ RNA-HCV.
- Spin hóa chất trước khi dùng.
- Chuẩn bị tủ vô trùng và các tube 0,2ml lên giá lạnh
- Đánh dấu các kí hiệu BP tương ứng lên các tube PCR. Hút vào mỗi ống PCR
+ 10 µl RT-mix
+ 0,4 µl RT-G-mix1
+ 0,5 µl MMLV
+ 10 µl sản phẩm tách chiết RNA BP
- Ủ master mix trên ở 370C trong 30 phút
- Bổ sung 20 µl TE-buffer.
8.3.2. Real-time PCR xác định genotype HCV
Sau khi tổng hợp xong cDNA, tiến hành định genotype của HCV với các bước như sau:
Bước 1: Đánh dấu các kí hiệu BP tương ứng lên các tube PCR, mỗi mẫu bệnh phẩm có 4 ống PCR tương ứng, kí hiệu theo thứ tự: 1b/3a; 1a/2; 4/IC và 5/6.
Chú ý: viết ký hiệu ở thành ống, tuyệt đối không viết lên nắp vì thiết bị chụp hín hiệu huỳnh quang từ trên nắp.
Bước 2: Chuẩn bị 4 master mix của 1b/3a; 1a/2; 4/IC và 5/6, bằng cách thêm vào mỗi ống PCR vô trùng:
+ 10 µl PCR mix 1 FRT genotype 1b/3a(hoặc 1a/2, hoặc 4/IC hoặc 5/6)
+ 5 µl RT-PCR-mix2-TM
+ 0,5 µl TaqF polymerase
Bước 3: Ly tâm để hóa chất lắng xuống đáy ống
Bước 4: Hút 15 µl master mix và 10 µl cDNA mẫu, chứng dương, chứng âm vào các ống tương ứng
Bước 5. Ly tâm các ống PCR để dịch lắng xuống đáy ống và đặt vào PCR plate ở các vị trí tương ứng.
Bước 6: Dùng giấy thấm lau thật sạch nắp ống trước khi đậy nắp máy. Nếu nắp ống bẩn hoặc chứa nước sẽ gây ra tình trạng tín hiệu huỳnh quang nhiễu và kết quả real-time PCR không chính xác.
Bước 7: Cài đặt chương trình chạy và tích vào ô pulse.
Stage |
Temp, oC |
Time |
Flourescense detection |
Cycle repeat |
Hold |
95 |
15 min |
- |
1 |
Cycling |
95 |
5s |
- |
5 |
60 |
20s |
- |
||
72 |
15s |
- |
||
Cycling |
95 |
5s |
- |
40 |
60 |
30s |
FAM, JOE/HEX/Cy3 |
||
72 |
15s |
|
Bước 8: Bấm nút khởi động chạy chương trình trên phần mềm và lưu file vào máy tính.
IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ
Sau khi kết thúc real-time PCR, chuyển sang chế độ Analysis và phân tích kết quả theo các trình tự sau:
Bước 1: Sau khi kết thúc real-time PCR, chuyển sang chế độ Analysis và phân tích kết quả:
- Trong tube ống PCR 1b/3:
+ cDNA HCV genotype 1b được phát hiện trên kênh FAM
+ cDNA HCV genotype 3 được phát hiện trong kênh HEX
- Ống PCR 1a/2
+ cDNA HCV genotype 1a được phát hiện trên kênh FAM
+ cDNA HCV genotype 2 được phát hiện trên kênh HEX
- Ống PCR 4/IC
+ cDNA HCV genotype 4 được phát hiện trên kênh FAM
+ IC được phát hiện trong kênh HEX
- Ống PCR 5a/6
+ cDNA HCV genotype 5a được phát hiện trên kênh FAM
+ cDNA HCV genotype 6 được phát hiện trên kênh HEX
Bước 2: Phân tích chứng dương và chứng ấm: Chỉ chọn chứng dương và chứng âm, chọn cả hai màu FAM/HEX. Xét nghiệm đạt yêu cầu nếu:
- Chứng dương:
- Chứng âm có đường biểu diễn thẳng và không có tín hiệu nền với cả hai màu FAM/HEX.
Bước 3: Phân tích mẫu BP, chọn cả màu FAM và HEX, có thể chọn dữ liệu ở chế độ đã xử lý hoặc chế độ thô để có kết quả chính xác nhất.
- Mẫu BP có đường biểu diễn dương tính tương ứng với genotype bào thì kết luận mẫu BP nhiễm genotype đấy, tín hiệu dương tính phải tương đương với tín hiệu dương tính trong phản ứng Real-time PCR định lượng HCV
- Trường hợp mẫu BP đồng nhiễm nhiều genotype HCV lấy genotype có đường biểu diễn dương tính mạnh nhất và trước chu kỳ 36.
- Không kết luận với đường biểu diễn dương tính không rõ ràng và dương tính từ chu kỳ 36 trở về sau
- Mẫu BP có đường biểu diễn âm tính với cả 7 serotype, kết luận mẫu nhiễm genotype khác ngoài 7serotype 1a,1b,2,3a,5,6.
X. LƯU Ý
10.1. Sai sót
Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả, thông thường do:
- Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn
- Chứng âm và những mẫu bệnh phẩm âm tính bị nhiễm chéo bởi huyết thanh/huyết tương có nồng độ kháng thể cao
- Dung dịch cơ chất bị nhiễm bởi các tác nhân oxy hóa (thuốc tẩy, ion kim loại…)
10.2. Xử trí
- Tuân thủ đúng các quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm
- Kiểm tra và vệ sinh máy thường xuyên trước và sau khi làm xét nghiệm
- Tuân thủ đúng quy trình xét nghiệm
XI. HỒ SƠ LƯU
- Lưu trữ các biểu mẫu phiếu QC theo đúng quy định của khoa.
XII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN
Tên tài liệu |
Mã tài liệu |
Quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm |
|
Sổ tay hướng dẫn lấy mẫu bệnh phẩm |
|
Quy trình an toàn phòng xét nghiệm |
|
Hướng dẫn sử dụng kit real-time PCR xác định genotype HCV |
|
(Lượt đọc: 1841)
Tin tức liên quan
- VS.QTKT.SHPT.08 REALTIME PCR XÁC ĐỊNH HSV
- VS.QTKT.SHPT.07 REALTIME PCR XÁC ĐỊNH Neisseria gonorrhoea
- VS.QTKT.SHPT.06 REALTIME PCR XÁC ĐỊNH CHLAMYDIA
- VS.QTKT.SHPT.05 REALTIME PCR XÁC ĐỊNH GENOTYPE HPV
- VS.QTKT.SHPT.04 REALTIME PCR XÁC ĐỊNH CMV
- VS.QTKT.SHPT.03 HCV ĐO TẢI LƯỢNG HỆ THỐNG TỰ ĐỘNG
- VS.QTKT.SHPT.02 HBV ĐO TẢI LƯỢNG HỆ THỐNG TỰ ĐỘNG
- VS.QTKT.SHPT.01 MYCOBACTERIUM TUBERTULOSIS
- VS.QTKT.NC.30.QUY TRÌNH CẤY KIỂM TRA PHÁT HIỆN KHÁNG THUỐC - NGƯỜI MANG
- VS.QTKT.NC.29.QUY TRÌNH CẤY KIỂM TRA NƯỚC
- Tiêu điểm
- Tin đọc nhiều