I. MỤC ĐÍCH

            Xác định DNA đặc trưng của Herpes simplex virus bằng hệ thống PCR tự động.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

      Áp dụng tại Khoa xét nghiệm Vi sinh - Bệnh viện đa khoa Tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• Quyết định 26/QĐ-BYT ban hành ngày 03/01/2013 về việc ban hành tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh Y học”
• Bộ Y tế, Giáo trình thực hành Vi sinh vật, NXB Y học, 2004.

IV. TRÁCH NHIỆM

• Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
• Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
• Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

V. ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

RT – PCR	Real Time Polymerase Chain Reaction
DNA	Deoxyribose Nucleic Acid
BP	Bệnh Phẩm
IC	Internal Control
HSV	Herpes simplex virus
RT – PCR	Real Time Polymerase Chain Reaction

VI. NGUYÊN LÝ

HSV (Herpes simplex virus) là những virus DNA có vỏ bọc, gây nhiễm cho tế bào người bởi đặc trưng gây tổn thương lớp niêm mạc và xuất hiện các tiểu thể nội bào. HSV có hai serotype là HAV-1 và HSV-2. Hai type này gây nhiễm những cơ quan khác nhau:

   HSV-1 được truyền qua những chất tiết của miệng gây bệnh điển hình ở “ trên thắt lưng” bao gồm các tổn thương ở miệng, mặt và mắt.

   HSV-2 được truyền qua các chất tiết của đường sinh dục và gây bệnh điển hình ở “dưới thắt lưng” bao gồm những loét của cơ quan sinh dục và nhiễm herpes của trẻ sơ sinh.

   Kỹ thuật RT-PCR có thể phát hiện được 2 serotype của HSV là HSV-1 và HSV-2 nhanh và chính xác VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

7.1. Trang thiết bị

- Máy ly tâm Centrifuge 5424R (Eppendorf)

- Máy ly tâm MF 80 ( Hanil)

- Tủ lạnh 2°C - 8°C

- Tủ âm sâu (-20°C)

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Tủ an toàn sinh học Esco PCR Cabinet

- Máy vortex

- Micropipettes 10µl, 100 µl, 1000 µl

- Máy ly tâm lắng mẫu nhanh cho tuve 0,2ml

- Máy tách chiết DNA – RNA tự động SaMag 12 – Sacase Biotechnology

- Máy SaCycler – 96 Real Time PCR System - Sacase Biotechnology

- Bộ lưu điện

7.2. Dụng cụ hóa chất, vật tư tiêu hao

- SaMag Viral Nucleic Acid Extraction Kit

- Khay đựng bệnh phẩm

- Hộp vận chuyển bệnh phẩm  

- Tube đựng bệnh phẩm  15ml, 50ml

- Đầu  côn  có  lọc  10µl , 100 µl, 1000 µl

- Effendorf  loại 1,5 ml vô trùng

- Giấy thấm 

- Giấy xét nghiệm 

- Sổ lưu kết quả xét nghiệm 

- Bút viết kính 

- Bút bi 

- Mũ 

- Khẩu trang 

- Găng không có bột

- Găng tay xử lý dụng cụ 

- Quần áo bảo hộ 

- Dung dịch nước rửa tay 

- Cồn sát trùng tay nhanh 

- Dung dịch khử trùng 

- Khăn lau tay 

- Dụng cụ để làm lạnh và giữ ống PCR

7.3. Mẫu bệnh phẩm

- Lấy mẫu bệnh phẩm theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.

- Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu.

VIII. NỘI DUNG

8.1. Lấy bệnh phẩm

   Cách lấy bệnh phẩm thực hiện theo quy trình lấy và vận chuyển bệnh phẩm mã số……..

8.2. Quy trình tách chiết DNA

8.2.1. Chuẩn bị

- Khởi động tủ an toàn sinh học, máy tách chiết DNA – RNA tự động ít nhất 15 phút trước khi thực hiện

- Sắp xếp các dụng cụ cần thiết vào tủ an toàn sinh học

- Đánh số thứ tự các mẫu bệnh  phẩm;

- Ghi nhãn, dán và đánh dấu  lên ống effendorf  loại 1,5 ml để đựng mẫu BP

- Đối với BP là dịch được quyệt bằng tăm bông vô trùng: Bẻ đầu tăm bông chứa BP vào ống effendorf 1,5ml, bổ sung 500 µl dung dịch TE 1X, sau đó vortex đều.

8.2.2. Quy trình tách chiết DNA bằng hệ thống tự động

1. Sắp xếp các protocol vào máy theo thứ tự có sẵn

2. Hút 10µl RNA carier  vào ống đựng bệnh phẩm

3. Hút tiếp 10µl IC vào ống chứa RNA carier

4. Cho 200µl huyết thanh  mẫu vào ống có chứa hỗn hợp RNA carier và IC

5. Chọn protocol barcode

6. Chọn Sample volume

7. Chọn elution tube type và elution volume

8. Chọn Run để tiến hành tách chiết DNA

9. DNA sau khi được tách chiết phải được bảo quản ở tủ đá có nhiệt độ -20⁰ C

8.3.  Quy trình RT – PCR xác định HSV

8.3.1. Khởi động máy và khai báo chương trình PCR

Bước 1: Khởi động máy

            - Bật máy real-time PCR ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình, tín hiệu xanh là báo hiệu khởi động máy thành công.

            - Bật máy tính và mở chương trình phần mềm

            - Kiểm tra kết nối giữa máy tính và máy real-time PCR: nút play màu xanh là kết nối thành công

Bước 2: Khai báo trên PCR plate

            - Xác định vị trí đặt ống PCR

            - Chọn unknown cho mẫu BP, chứng âm và chứng dương, khai báo tên hoặc số tương ứng với mẫu.

            - Lựa chọn màu FAM + HEX cho mẫu BP, chứng dương và chứng âm. Trong đó, FAM phát hiện HSV và HEX phát hiện chứng nội tại.

            - Khai báo các thông số khác: Thể tích chạy mẫu là 25µl, kỹ thuật gắn chất phát quang là Tagman và dạng ống PCR - 0.2 ml corning tube.

Bước 3: Cài đặt chương trình luân nhiệt và tích vào ô pulse

1 Chu kỳ	95oC - 15 phút
5 Chu kỳ	95oC - 5 giây
	60oC - 20 giây
	72oC -15 giây
40 chu kỳ	95oC - 5 giây
	60oC - 30 giây + chụp hình
	72oC - 15 giây

8.3.2. Real-time PCR xác định HSV

Bước 1: Chuẩn bị tủ vô trùng và các tube 0.2 ml đặt trên các giá lạnh

Bước 2: Đánh dấu các ký hiệu mẫu BP tương ứng lên các tube PCR: viết ký hiệu lên thành ống, tuyệt đối không viết lên nắp, vì máy chụp hình từ trên nắp ống.

Bước 3: Hút vào mỗi tube PCR

+ 10 µl PCR mix 1 FRT

+ 5 µl PCR mix 2 FRT

+ 0,5 µl TaqF polymerase

+ 0,5 µl IC

Bước 4: Hút 10 µl chứng dương và dung dịch DNA mẫu BP vào các tube tương ứng). Thao tác mẫu nào, chỉ mở nắp ống PCR tương ứng, thực hiện xong đóng thật chặt nắp tube ngay để tránh lây nhiễm.

Bước 5: Ly tâm các ống PCR để dịch lắng xuống đáy ống và đặt vào PCR plate ở các vị trí tương ứng.

Bước 6: Dùng giấy thấm lau thật sạch nắp ống trước khi đậy nắp máy. Nếu nắp ống bẩn hoặc chứa nước sẽ gây ra tình trạng tín hiệu huỳnh quang nhiễu và kết quả real-time PCR không chính xác.

Bước 7: Bấm nút khởi động chạy chương trình trên phần mềm và lưu file vào máy tính.

IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

Sau khi kết thúc real-time PCR, chuyển sang chế độ Analysis và phân tích kết quả theo các trình tự sau:

Bước 1: Kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm

            - Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu ROX

            - Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu ROX: mẫu không bị ngoại nhiễm. Vì vậy có thể đọc kết quả mẫu chứng (+) và mẫu BP.

            - Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu ROX: mẫu bị ngoại nhiễm, phải tiến hành tách chiết DNA lại.

Bước 2: Kiểm tra độ nhạy

            - Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu ROX

            - Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu ROX: PCR không bị ức chế.

            - Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại hoặc tín hiệu thấp với kênh màu ROX, PCR bị ức chế toàn phần hay một phần, tách chiết DNA lại  hoặc pha loãng DNA trước khi chạy PCR.

Bước 3: Kiểm tra độ nhạy của master mix

            - Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

            - Đọc kết quả Ct của chứng (+), số copy 100 - Ct = 30 - <33.36 là khoảng chấp nhận được.

Bước 4: Xác định mẫu dương tính HSV

            - Chọn từng mẫu BP + chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

            - Mẫu BP có tín hiệu huỳnh quang dương tính với FAM  là những mẫu dương tính HSV type 1

- Mẫu BP có tín hiệu huỳnh quang dương tính với HEX là những mẫu dương tính  type 2

            - Các mẫu BP có Ct <12 và tín hiệu huỳnh quang không tăng theo chu kỳ nhiệt: pha loãng DNA mẫu BP với tỉ lệ 1/5 trước khi cho vào PCR master mix

Bước 5: Xác định mẫu BP âm tính HSV

- Chọn từng mẫu BP,  chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Mẫu BP không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và HEX đồng thời dương tính với màu ROX thì kết quả là mẫu BP âm tính với HSV

- Nếu mẫu BP có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM hoặc HEX nhưng không có Ct và dương tính với màu ROX, thì kết quả là HSV trong BP dưới ngưỡng phát hiện

- Nếu mẫu BP không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM, HEX và âm tính với màu ROX, thì mẫu BP bị ức chế cần tiến hành lại PCR với DNA đã pha loãng hoặc tách chiết lại. Nếu kết quả vẫn như cũ thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm.

IX. LƯU Ý

9.1. Sai sót

Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả, thông thường do:

- Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn

- Chứng âm và những mẫu bệnh phẩm âm tính bị nhiễm chéo bởi huyết thanh/huyết tương có nồng độ kháng thể cao

- Dung dịch cơ chất bị nhiễm bởi các tác nhân oxy hóa (thuốc tẩy, ion kim loại…)

9.2. Xử trí

- Tuân thủ đúng các quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm

- Kiểm tra và vệ sinh máy thường xuyên trước và sau khi làm xét nghiệm

- Tuân thủ đúng quy trình xét nghiệm

X. HỒ SƠ LƯU

• Lưu trữ các biểu mẫu phiếu QC theo đúng quy định của khoa.

XI. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

Tên tài liệu	Mã tài liệu
Quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm
Sổ tay hướng dẫn lấy mẫu bệnh phẩm
Quy trình an toàn phòng xét nghiệm
Hướng dẫn sử dụng kit real-time PCR xác định HSV