I. MỤC ĐÍCH

            Mô tả và hướng dẫn thực hiện quy trình xét nghiệm phát hiện định lượng  RNA của virus  HIV-1 trong mẫu máu trên hệ thống máy ABBOTT m2000.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

      Áp dụng tại Khoa Vi sinh - Bệnh viện đa khoa Tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• Quyết định 26/QĐ-BYT ban hành ngày 03/01/2013 về việc ban hành tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh Y học”
• Hướng dẫn vận hành hệ thống máy ABBOTT m2000 của nhà sản xuất.

IV. TRÁCH NHIỆM

• Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
• Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
• Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

V. ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

QLCL	Quản lý chất lượng
QTKT	Quy trình kỹ thuật
HIV-1	Human Immuno-deficiency Virus type 1
RNA	Ribonucleic acid
PCR	Polymerase chain reaction (Phản ứng khuyếch đại chuỗi)
Ct	Threshold cycle (Chu kỳ ngưỡng)
IC	Chứng nội (Internal control)
IU	International Units

 

 

VI. NGUYÊN LÝ

       Định lượng HIV-1 trong mẫu bệnh phẩm dựa trên nguyên lý của kỹ thuật Real time PCR gồm 2 giai đoạn:

• Tách chiết RNA
• Khuyếch đại RNA sử dụng mồi và mẫu dò đặc hiệu của HIV-1. Chứng nội được thêm vào mẫu từ lúc chuẩn bị mẫu tự động và khuyếch đại phát hiện đồng thời với mỗi mẫu để kiểm soát toàn bộ quá trình.  

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

7.1. Trang thiết bị

• Tủ an toàn sinh học.
• Máy vortex.
• Máy ủ (dành cho ống có đường kính khoảng 16mm)
• Hệ thống máy máy tách chiết tự động Abbott m2000sp và máy tự động khuyếch đại và phát hiện Abbott m2000rt
• Máy tính có cài đặt phần mềm điều khiển (cho từng máy: máy tách chiết m2000sp và máy khuếch đại m2000rt) có cài ứng dụng 1.0ml HIV-1 RNA
• Máy in được kết nối với máy tính điều khiển máy khuếch đại m2000rt

7.2. Dụng cụ hóa chất, vật tư tiêu hao

• Pipette và đầu côn có lọc loại 1000 ml
  • Đầu côn có phin lọc thể tích 1000 ml
  • Đầu côn có phin lọc thể tích 200 ml
  • Khay (Rack) đựng ống mẫu đầu vào
  • Ống phản ứng (reaction vessels) 5ml
  • Máng đựng hóa chất (reagent vessels) 200ml
  • Đĩa 96 giếng sâu (Deep well plate)
  • Ống 5ml master mix
  • Đĩa PCR 96 giếng
  • Miếng dán phủ đĩa PCR
  • Găng tay không bột tal
  • Các dụng cụ và hóa chất cơ bản khác trong phòng thí nghiệm.

7.3. Hóa chất, sinh phẩm

Bộ sinh phẩm để thực hiện xét nghiệm là bộ kit 96 test gồm:

7.3.1. Abbott mSample Preparation SystemRNA (4 x 24 Preps)

7.3.2. Abbott RealTime HIV-1 Amplification Reagent Kit (4 x 24 test), bao gồm:

            - Abbott RealTime HIV-1 Internal Control (4 ống)

            - Abbott RealTime HIV-1 Amplification Reagent Pack (4 x 24 test)

7.3.3. Abbott RealTime HIV-1 Control Kit, bao gồm:

            - Abbott RealTime HIV-1 Negative Control (8 ống)

            - Abbott RealTime HIV-1 Low Positive Control (8 ống)

            - Abbott RealTime HIV-1 High Positive Control (8 ống)

7.3.4.Abbott RealTime HIV-1 Calibrator Kit, bao gồm:

            - Abbott RealTime HIV-1 Calibrator A (12 ống)

             - Abbott RealTime HIV-1 Calibrator B (12 ống)

VIII. NỘI DUNG

8.1. Bệnh phẩm

            Mẫu máu: bệnh phẩm phải có đầy đủ thông tin, đủ số lượng theo yêu cầu xét nghiệm, lọ đựng bệnh phẩm phải được đậy chặt.

            Quy trình lấy máu theo Sổ tay lấy mẫu bệnh phẩm của Khoa Vi sinh.

8.2. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm, hóa chất trước khi đưa vào máy tách chiết Abbott m2000sp

           - Ly tâm ống đựng máu để tách huyết thanh hoặc huyết tương  theo quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm của Khoa Vi sinh.

           - Lấy các hóa chất ra khỏi tủ lạnh để rã đông hoàn toàn.

Lưu ý:

                       + Calibrator, Control, IC được rã đông 1 lần ở nhiệt độ phòng hoặc  2- 8^oC và dùng trong vòng 24 giờ sau khi rã đông.

                          + Hóa chất khuếch đại (Amplification Reagent Pack) được rã đông 1 lần ở nhiệt độ phòng hoặc 2 – 8^oC và sử dụng khi master mix. Nếu không dùng hết, có thể được lưu lại và sử dụng tối đa 2 lần hoặc trong vòng 14 ngày.

8.3. Tách chiết RNA và vận hành máy Abbott m2000sp

           1. Khởi động máy Abbott m2000sp và truy cập vào phần mềm điều khiển.

           2. Thực hiện kiểm tra, bảo dưỡng vệ sinh hệ thống máy.

           3. Chọn ứng dụng 1.0ml HIV-1 RNA trong danh sách các ứng dụng chạy trên máy.

           4. Xét nghiệm Abbott  RealTime HIV-1 có thể chạy tối đa với mẻ từ 1-93 mẫu cùng với ba gồm 1 chứng âm và hai chứng dương.

           5. Đặt các ống master mix chứa mẫu bệnh đã chuẩn bị

              Lưu ý : Không được bỏ trống bất cứ vị trí nào trên khay đựng mẫu. Nạp mẫu và  các mẫu chứng vào khay ở các vị trí liền nhau, bắt đầu từ vị trí đầu tiên trong giá mẫu đầu tiên. Dùng hết các vị trí của giá đựng mẫu đầu tiên trước rồi mới đến giá đựng mẫu thứ hai, hết khay thứ 2 mới đến khay thứ 3, không bỏ trống bất kỳ vị trí nào.

              6. Cho khay chứa mẫu vào vị trí trên máy Abbott m2000sp mà máy yêu cầu (các vị trí được đánh số từ 1 – 6 tương ứng với 6 khay chứa mẫu). Đặt chứng âm và 2 mẫu chứng dương vào khay chứa mẫu cùng với các mẫu bệnh khác. Nếu có ống calibrator cần chạy thì đặt cùng vào khay chứa mẫu giống như các ống chứng.

              Lưu ý: Quay phía có mã vạch trên các ống chứa mẫu về bên phải để máy có thể quét đọc mã vạch.

              7. Máy sẽ tự động quét nhận diện các mẫu đã có mã vạch. Với những mẫu không có mã vạch, có thể nhập tay thủ công tên/ mã mẫu.

              8. Nạp vật tư tiêu hao theo hướng dẫn của phần mềm . Yêu cầu phải đúng và đủ về chủng loại và số lượng vật tư tiêu hao.

              9. Nạp tất cả các hóa chất tách chiết theo hướng dẫn của phần mềm.

              Lưu ý:

   -  Để thực hiện từ 1 - 24 phản ứng/ lần chạy cần 1 set gồm: 1 lọ Internal control, 1 bộ thuốc thử khuếch đại, và một bộ (mỗi loại 1 chai) thuốc thử chuẩn bị mẫu mSample Preparation SystemRNA.

              - Để thực hiện từ 25 - 48 phản ứng/ lần chạy cần 2 set, từ 49 - 72 phản ứng/ lần chạy cần 3 set và 73 - 96 phản ứng/ lần chạy cần 4 set như trên, TRỪ mMICROPARTICLES. Từ 25 - 96 mẫu/ lần chạy chỉ cần dùng hai chai  Mmicroparticles

              - Để lọ IC rã đông hoàn toàn, vortex khoảng 2 -3 giây. Sử dụng pipet chuyên để hút IC, hút 750ul IC cho vào MỖI chai đệm mLysis RNA buffer được sử dụng.

              - Trước khi đổ mMicroparticlesRNA vào máng đựng hóa chất 200 mL, khuấy hoặc lắc trộn cho đến khi mMicroparticlesRNA phân tán hoàn toàn.

           -     Các máng chứa thuốc thử  phải có phần mã vạch được hướng về phía bên phải của máy để bộ phận quét mã vạch có thể đọc được.

10. Kiểm tra tất cả vật tư tiêu hao và hóa chất trên máy theo đúng như phần mềm yêu cầu.

11. Bắt đầu quá trình tách RNA bằng cách nhấp vào “START RUN”.

12. Sau khi hoàn thành quá trình tách, thực hiện master mix trên máy bằng cách chọn Master mix addition  - Chọn tên Deep well plate vừa hoàn thành tách chiết  - Set up run – Thực hiện theo hướng dẫn của chương trình.

Lưu ý:

           - Việc mastermix  phải được thực hiện càng sớm càng tốt, và  không quá 60 phút sau khi hoàn thành việc tách chiết DNA.

      - Trước khi thực hiện Master mix cần chuẩn bị vật tư tiêu hao và hóa chất đầy đủ:

      + Hóa chất khuếch đại (Đã bỏ nắp, đặt đúng vị trí và đúng chiều).

      + Tube Master mix trống: Bỏ nắp, đặt từ vị trí đầu tiên.

      + Deep well plate có sản phẩm sau khi tách chiết.

      + Plate 96 giếng để chạy Realtime PCR

      + Đầu côn có phin lọc 1000ul và 200ul đủ.

      + Dán kín đĩa 96 giếng, chuyển đĩa sang máy Abbott m2000rt để chạy khuyếch đại và phát hiện.     

      + Để chuyển dữ liệu sang máy Abbott m2000rt: Vào  Result – View by PCR plate – Chọn đúng tên đĩa PCR vừa mastermix xong – Export plate (Có thể chọn Export kết quả vào đĩa CD để chuyển sang máy tính của m2000rt hoặc Export qua Network)

8.4. Khuyếch đại HIV-1 và đọc kết quả trên máy Abbott m2000rt

            1. Bật máy m2000rt khoảng 20 phút trước khi chuyển đĩa PCR sang (bắt đầu khởi động máy m2000rt khi bắt đầu làm Master mix), bao gồm: Bật nút khởi động trên máy + Nhấp “Start” trên màn hình máy tính.

            2. Sau khi dán kín đĩa PCR 96 giếng xong, ấn nút Open trên máy Abbott m2000rt để mở vị trí đặt đĩa, đặt đĩa đã dán miếng phủ vào. Ấn nút đóng lại.

            3. Vào “Order” để nhấp chọn thông tin đĩa PCR đã được export từ máy tách chiết.

            4. Bắt đầu khuếch đại và phát hiện bằng cách nhấp “Start run”.

            5. Sau khi kết thúc khuyếch đại, đèn sẽ chuyển sang màu da cam (khi chạy sẽ nhấp nháy đèn xanh)

            6. Đọc kết quả trên phần mềm và in kết quả

            7. Lấy đĩa PCR trong máy Abbott m2000rt ra để tránh tình trạng máy bị nhiễm.

8.5. Đọc kết quả và báo cáo

            - Nồng độ RNA của virus HIV-1 trong mẫu hoặc chứng được tính từ đường chuẩn hiệu chuẩn được dựng cùng lần chạy đó hoặc từ đường hiệu chuẩn được lưu trữ trước đó trong phần mềm. Phần mềm sẽ tự động tính toán và báo cáo kết quả trên máy của Abbott m2000rt.

            - Kết quả có thể được báo cáo bằng các đơn vị: copies / mL, log[copies / mL], IU / mL, hoặc log [IU / mL]; (1 IU = 0,58 bản, 1 bản = 1,74 IU).

            - Đọc  kết quả hiển thị:

            + Not detected: trình tự đích không được phát hiện trong mẫu ban đầu

            + Detected:  có < 839 copies/ml Hoặc có từ 839 copies/ml – 10 triệu copies/ml (Cho ra kết quả là 1 số xác định) trong mẫu ban đầu

            + > ULQ: có > 10 triệu copies/ ml trong mẫu ban đầu.

8.6. Bảo dưỡng cuối ngày: Hoàn tất công việc vệ sinh máy.

XI. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

            - Trước khi xét nghiệm cần kiểm tra các yếu tố sau để xác định xem có thể sử dụng đường chuẩn đang lưu trong máy hay không hay phải xây dựng đường chuẩn mới (bằng cách tách chiết và khuếch đại các mẫu calibrator cùng các ống mẫu)

            + Thể tích mẫu tách chiết

            + Số lô (Lot number) sinh phẩm Abbott Sample preparation system RNA

            + Số lô sinh phẩm Abbott Realtime HIV-1 Amplification reagent

            + Thời gian tính từ lần dựng đường chuẩn trước (cho phép trong 6 tháng)

            + Có cài phiên bản phần mềm ứng dụng mới trên m2000sp và m2000rt

            + Hiệu chuẩn quang cho máy m2000rt (Đặc biệt là các màu FAM, VIC, ROX là các màu được sử dụng trong xét nghiệm này).

            + Nếu một trong các yếu tố trên thay đổi, sẽ cần dựng lại đường chuẩn mới (chạy mẫu calibrator mới: 3A + 3B)

            - Kết quả chấp nhận được nếu :

            + Chứng âm: Sự hiện diện của HIV-1 không được phát hiện sau quá trình khuếch đại

            + Chứng dương thấp và cao: Cho giá trị xác định nằm trong phạm vi cho phép.

            - Kết quả sẽ không được chấp nhận nếu:

            + Trong lần chạy thiếu các chứng dương và chứng âm.

            + Cờ báo IC: Mẫu chứng nội bộ (IC) trong mỗi mẫu xét nghiệm dùng để xác nhận rằng mỗi mẫu đều đã được xử lý đúng cách và thể hiện có hay không có ức chế khuếch đại. Thông số chu kỳ ngưỡng của IC (Ct) đã được xác định trong quá trình chạy  mẫu hiệu chuẩn. Một lượng IC xác định, nhất quán được đưa vào mỗi mẫu,  mỗi chứng và mỗi mẫu hiệu chuẩn ở khâu chuẩn bị mẫu và được đo bằng Abbott m2000rt để chứng minh tính hợp lệ của các mẫu. Vì IC bao gồm một trình tự RNA không liên quan đến trình tự đích của HIV-1, chu kỳ khuếch đại trung bình mà tại đó tín hiệu huỳnh quang của chuỗi đích mục tiêu của IC được phát hiện trong các mẫu hiệu chuẩn, sẽ xác định phạm vi hiệu lực của IC Ct đối với tất cả các mẫu được xử lý tiếp theo.Một lá cờ lỗi sẽ được hiển thị khi một mẫu hoặc một chứng nào đó không đáp ứng được yêu cầu này. Mẫu nào có giá trị IC Ct vượt quá phạm vi đã được xác lập phải được kiểm tra lại bắt đầu bằng việc chuẩn bị mẫu.

            + HIV-1 được phát hiện trong chứng âm: vì đây là dấu hiệu nhiễm bẩn do các mẫu khác hoặc do sản phẩm khuếch đại được đưa vào trong quá trình chuẩn bị mẫu hoặc quá trình chuẩn bị mastermix. Kiểm soát âm và dương

            + Cờ báo lỗi Control: Một chứng âm, một chứng dương nồng độ thấp và một chứng dương nồng độ cao được đưa vào mỗi lần chạy mẫu để đánh giá hiệu lực. Các giá trị cụ thể của chứng dương thấp và chứng dương cao được quy định trong mỗi  thẻ (card) đi kèm bộ kit  Abbott RealTime HIV-1 Control Kit và phải được điền thông tin vào phần mềm điều khiển khi bắt đầu thực hiện tách chiết. Cờ báo lỗi Control hiển thị khi một/ nhiều kết quả  của chứng dương nằm ngoài phạm vi cho phép. Nếu âm hoặc chứng dương tính nằm ngoài phạm vi, tất cả các mẫu và các kiểm soát từ quá trình đó phải được kiểm tra lại, bắt đầu bằng việc chuẩn bị mẫu.

X. AN TOÀN

Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm theo quy trình về an toàn xét nghiệm mã hiệu VS.QTQL.10.

XI. LƯU Ý

            Việc lấy mẫu, vận chuyển và bảo quản không đúng tiêu chuẩn có thể dẫn đến kết quả sai, cho dù phản ứng được thực hiện đúng.

XII. HỒ SƠ LƯU

• Lưu trữ các biểu mẫu phiếu QC theo đúng quy định của khoa.

XIII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

Tên tài liệu	Mã tài liệu
Quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm
Sổ tay hướng dẫn lấy mẫu bệnh phẩm