I. MỤC ĐÍCH

Quy định thống nhất cách thức triển khai các bước tách chiết DNA/RNA tự động, nhằm đảm bảo độ tinh sạch và độ thu hồi DNA/RNA mẫu bệnh phẩm trước khi tiến hành phản ứng real-time PCR.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

Áp dụng tại Khoa xét nghiệm Vi sinh - Bệnh viện đa khoa Tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• Quyết định 26/QĐ-BYT ban hành ngày 03/01/2013 về việc ban hành tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh Y học”
• Bộ Y tế, Giáo trình thực hành Vi sinh vật, NXB Y học, 2004.

IV. TRÁCH NHIỆM

• Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
• Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
• Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

V. ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

RT – PCR	Real Time Polymerase Chain Reaction
DNA	Deoxyribose Nucleic Acid
BP	Bệnh Phẩm
IC	Internal Control
RT – PCR	Real Time Polymerase Chain Reaction

 

VI. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

6.1. Trang thiết bị

- Máy ly tâm Centrifuge 5424R (Eppendorf)

- Máy ly tâm MF 80 ( Hanil)

- Tủ lạnh 2°C - 8°C

- Tủ âm sâu (-20°C)

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Tủ an toàn sinh học Esco PCR Cabinet

- Máy vortex

- Micropipettes 10µl, 100 µl, 1000 µl

- Máy ly tâm lắng mẫu nhanh cho tuve 0,2ml

- Máy tách chiết DNA – RNA tự động SaMag 12 – Sacase Biotechnology

- Máy SaCycler – 96 Real Time PCR System - Sacase Biotechnology

- Bộ lưu điện

6.2. Dụng cụ hóa chất, vật tư tiêu hao

- SaMag Viral Nucleic Acid Extraction Kit

- Kít định lượng virus HBV Real-TM (HBV Real-TM Quant Dx): Đạt tiêu chuẩn ISO 9001:2008 & 13485:2012.

- Khay đựng bệnh phẩm

- Hộp vận chuyển bệnh phẩm  

- Tube đựng bệnh phẩm  15ml, 50ml

- Đầu  côn  có  lọc  10µl , 100 µl, 1000 µl

- Effendorf  loại 1,5 ml vô trùng

- Giấy thấm 

- Giấy xét nghiệm 

- Sổ lưu kết quả xét nghiệm 

- Bút viết kính 

- Bút bi 

- Mũ 

- Khẩu trang 

- Găng không có bột

- Găng tay xử lý dụng cụ 

- Quần áo bảo hộ 

- Dung dịch nước rửa tay 

- Cồn sát trùng tay nhanh 

- Dung dịch khử trùng 

- Khăn lau tay 

- Dụng cụ để làm lạnh và giữ ống PCR

6.3. Mẫu bệnh phẩm

- Lấy mẫu bệnh phẩm theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.

- Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu.

VII. NỘI DUNG

7.1. Chuẩn bị hóa chất và mẫu

+ Hóa chất tách chiết được đánh dấu theo thứ tự các bước 1-5 và để ở nhiệt độ phòng 15 phút, đảm bảo các hóa chất tan hoàn toàn trước khi sử dụng

+ Chuẩn bị các bệnh phẩm và đánh số thứ tự mẫu trên nắp và thành eppendorf.

7.2. Tách chiết DNA/RNA

BƯỚC 1:

• Cho 300 µl dung dịch lysis solution vào các ống đã đánh dấu
• Cho 100 µl bệnh phẩm, Vortex đều làm tan bệnh phẩm.
• Ủ ở 65°C trong vòng 5 phút
• Spin 10 sec nhằm lắng dung dịch ngưng tụ trên nắp ống xuống, tránh tạo khí dung khi mở nắp ống

BƯỚC 2:

• Cho 400 µl dung dịch prec sol vào ống đựng bệnh phẩm
• Trộn đều bằng đảo nhẹ ống eppendorf (inverse) tránh lắc và Vortex
• Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, sẽ có cặn  là xác tế bào màu xám nằm ở đáy ống
• Loại dung dịch phía trên và thu cặn

BƯỚC 3:

• Cho 500 µl dung dịch Washing solution 3
• Trộn đều tương tự bước 2
• Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút
• Loại dung dịch phía trên và thu cặn

BƯỚC 4:

• Cho 200 µl dung dịch Washing solution 4
• Trộn đều tương tự bước 2
• Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút
• Dùng pipette hút dung dịch phía trên và thu cặn

BƯỚC 5:

• Làm khô ở 65°C trong vòng 10 – 15 phút để cặn khô hoàn toàn
• Bổ sung 50 - 100 µl dung dịch Re – buffer
• Ủ ở 65° trong 5 phút.
• Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút trước khi sử dụng dịch DNA/RNA

VIII. HỒ SƠ LƯU

• Lưu trữ các biểu mẫu phiếu QC theo đúng quy định của khoa.

IX. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

Tên tài liệu	Mã tài liệu
Quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm
Sổ tay hướng dẫn lấy mẫu bệnh phẩm
Quy trình an toàn phòng xét nghiệm