I. MỤC ĐÍCH

            Xác định DNA đặc trưng của Rickettsia bằng hệ thống tự động.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

      Áp dụng tại Khoa xét nghiệm Vi sinh - Bệnh viện đa khoa Tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• Quyết định 26/QĐ-BYT ban hành ngày 03/01/2013 về việc ban hành tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh Y học”
• Bộ Y tế, Giáo trình thực hành Vi sinh vật, NXB Y học, 2004.

IV. TRÁCH NHIỆM

• Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
• Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
• Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

V. ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

RT – PCR	Real Time Polymerase Chain Reaction
DNA	Deoxyribose Nucleic Acid
BP	Bệnh Phẩm
IC	Internal Control
RIC	Rickettsia
RT – PCR	Real Time Polymerase Chain Reaction

VI. NGUYÊN LÝ

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhằm phát hiện gene của Rickettsia theo nguyên lý phương pháp realtime – PCR.

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

7.1. Trang thiết bị

- Máy ly tâm Centrifuge 5424R (Eppendorf)

- Máy ly tâm MF 80 ( Hanil)

- Tủ lạnh 2°C - 8°C

- Tủ âm sâu (-20°C)

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Tủ an toàn sinh học Esco PCR Cabinet

- Máy vortex

- Micropipettes 10µl, 100 µl, 1000 µl

- Máy ly tâm lắng mẫu nhanh cho tuve 0,2ml

- Máy tách chiết DNA – RNA tự động SaMag 12 – Sacase Biotechnology

- Máy SaCycler – 96 Real Time PCR System - Sacase Biotechnology

- Bộ lưu điện

7.2. Dụng cụ hóa chất, vật tư tiêu hao

- SaMag Viral Nucleic Acid Extraction Kit

- Khay đựng bệnh phẩm

- Hộp vận chuyển bệnh phẩm  

- Tube đựng bệnh phẩm  15ml, 50ml

- Đầu  côn  có  lọc  10µl , 100 µl, 1000 µl

- Effendorf  loại 1,5 ml vô trùng

- Giấy thấm 

- Giấy xét nghiệm 

- Sổ lưu kết quả xét nghiệm 

- Bút viết kính 

- Bút bi 

- Mũ 

- Khẩu trang 

- Găng không có bột

- Găng tay xử lý dụng cụ 

- Quần áo bảo hộ 

- Dung dịch nước rửa tay 

- Cồn sát trùng tay nhanh 

- Dung dịch khử trùng 

- Khăn lau tay 

- Dụng cụ để làm lạnh và giữ ống PCR

7.3. Mẫu bệnh phẩm

- Lấy mẫu bệnh phẩm theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.

- Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu.

VIII. NỘI DUNG

Bước 1. Chuẩn bị

- Khởi động tủ an toàn sinh học ít nhất 15 phút trước khi thực hiện

- Sắp xếp các dụng cụ cần thiết vào tủ an toàn sinh học

- Khởi động máy tách chiết DNA/RNA tự động SaMag 12–Sacase Biotechnology

- Đánh số thứ tự các mẫu bệnh  phẩm; ghi nhãn; dán và đánh dấu  lên ống faclcon 15ml và effendorf  loại 1,5 ml để đựng mẫu BỆNH PHẨM.

Bước 2. Tách chiết DNA bằng hệ thống tự động (theo quy trình tách chiết DNA/RNA tự động)

- Sắp xếp các protocol vào máy theo thứ tự có sẵn

- Đánh số thứ tự mẫu BỆNH PHẨM, chứng dương, chứng âm vào ống đựng BỆNH PHẨM và ống đựng DNA trên khay đựng BỆNH PHẨM của máy tách chiết DNA/RNA tự động.

- Sử dụng micropipette  hút 10µl RNA carier  và 10µl RICKETTSIA–IC vào các ống đựng bệnh phẩm

- Sử dụng micropipette  hút 200 µl BỆNH PHẨM, chứng dương, chứng âm vào các ống đựng BỆNH PHẨM theo số thứ tự

- Đặt khay đựng mẫu BỆNH PHẨM vào máy tách chiết DNA – RNA tự động

- Sử dụng đầu đọc mã code FCO AS – 8120 để nhập protocol barcode, sample volume, elution tube type và elution volume vào máy.

- Ấn nút Enter trên màn hình để máy bắt đầu tách chiết DNA.

- Sau khi máy tách chiết DNA – RNA chạy xong, lấy RNA ra khỏi máy, loại bỏ các Protocol và bật tia UV để khử trùng máy.

- DNA sau khi được tách chiết phải bảo quản ở tủ -20°C.

Bước 3: Chạy Real Time PCR bằng hệ thống máy SaCycler – 96 Real Time PCR System

Bước 1: Khởi động máy

   - Bật máy real-time PCR ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình, tín hiệu xanh là báo hiệu khởi động máy thành công.

   - Bật máy tính và mở chương trình phần mềm

   - Kiểm tra kết nối giữa máy tính và máy real-time PCR: nút play màu xanh là kết nối thành công

Bước 2: Khai báo trên PCR plate

            - Xác định vị trí đặt ống PCR

            - Chọn unknown cho mẫu BP, chứng âm và chứng dương, khai báo tên hoặc số tương ứng với mẫu.

            - Lựa chọn màu FAM + HEX cho mẫu BP, chứng dương và chứng âm. Trong đó, FAM phát hiện CHT và HEX phát hiện chứng nội tại.

            - Khai báo các thông số khác: Thể tích chạy mẫu là 20µl, kỹ thuật gắn chất phát quang là Tagman và dạng ống PCR - 0.2 ml corning tube.

Bước 3: Cài đặt chương trình luân nhiệt và tích vào ô pulse

1 Chu kỳ	37oC - 15 phút
1 Chu kỳ	95oC - 15 phút
50 chu kỳ	95oC - 10 giây
	60oC - 60 giây + chụp hình

8.3.2. Real-time PCR xác định Rickettsia

Bước 1: Chuẩn bị tủ vô trùng và các tube 0.2 ml đặt trên các giá lạnh

Bước 2: Đánh dấu các ký hiệu mẫu BP tương ứng lên các tube PCR: viết ký hiệu lên thành ống, tuyệt đối không viết lên nắp, vì máy chụp hình từ trên nắp ống.

Bước 3: Pha loãng DNA/RNA mẫu theo tỉ lệ 1/20: (10  µl DNA + 190µl nước)

Bước 4: Hút vào mỗi tube PCR

+ 10 µl 2x PCR master mix

+ 1 µl Rickettsia primer/probe

+ 1 µl Internal extraction control primer/probe mix

+ 3 µl RNAase/ DNAase free water

Bước 5: Hút 5 µl chứng dương và dung dịch DNA/RNA mẫu BP vào các tube tương ứng). Thao tác mẫu nào, chỉ mở nắp ống PCR tương ứng, thực hiện xong đóng thật chặt nắp tube ngay để tránh lây nhiễm.

Bước 5: Ly tâm các ống PCR để dịch lắng xuống đáy ống và đặt vào PCR plate ở các vị trí tương ứng.

Bước 6: Dùng giấy thấm lau thật sạch nắp ống trước khi đậy nắp máy. Nếu nắp ống bẩn hoặc chứa nước sẽ gây ra tình trạng tín hiệu huỳnh quang nhiễu và kết quả real-time PCR không chính xác.

Bước 7: Bấm nút khởi động chạy chương trình trên phần mềm và lưu file vào máy tính.

 IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

Sau khi kết thúc real-time PCR, chuyển sang chế độ Analysis và phân tích kết quả theo các trình tự sau:

Bước 1: Kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm

- Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu không bị ngoại nhiễm. Vì vậy có thể đọc kết quả mẫu chứng (+) và mẫu BỆNH PHẨM.

- Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu bị ngoại nhiễm, phải tiến hành tách chiết DNA lại.

Bước 2: Kiểm tra độ nhạy

- Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu HEX: PCR không bị ức chế.

- Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại hoặc tín hiệu thấp với kênh màu HEX, PCR bị ức chế toàn phần hay một phần, tách chiết DNA lại  hoặc pha loãng DNA trước khi chạy PCR.

Bước 3: Kiểm tra độ nhạy của master mix

- Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Đọc kết quả Ct của chứng (+), số copy 100 - Ct = 30 - <33.36 là khoảng chấp nhận được.

Bước 4: Xác định mẫu dương tính RICKETTSIA

- Chọn từng mẫu BỆNH PHẨM + chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM

- Mẫu BỆNH PHẨM có tín hiệu huỳnh quang với kênh màu FAM và có Ct: là những mẫu dương tính RICKETTSIA

- Các mẫu BỆNH PHẨM có Ct <12 và tín hiệu huỳnh quang không tăng theo chu kỳ nhiệt: pha loãng DNA mẫu BỆNH PHẨM với tỉ lệ 1/5 trước khi cho vào PCR master mix

Bước 5: Xác định mẫu BỆNH PHẨM âm tính RICKETTSIA

- Chọn từng mẫu BỆNH PHẨM + chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

- Mẫu BỆNH PHẨM không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và dương tính với màu HEX, thì kết quả là mẫu BỆNH PHẨM âm tính với RICKETTSIA

- Nếu mẫu BỆNH PHẨM có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM nhưng không có Ct và dương tính với màu HEX, thì kết quả là RICKETTSIA trong BỆNH PHẨM dưới ngưỡng phát hiện

- Nếu mẫu BỆNH PHẨM không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và âm tính với màu HEX, thì mẫu BỆNH PHẨM bị ức chế cần tiến hành lại PCR với DNA đã pha loãng hoặc tách chiết lại. Nếu kết quả vẫn như cũ thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm.

X. LƯU Ý

10.1. Sai sót

Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả, thông thường do:

- Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn

- Chứng âm và những mẫu bệnh phẩm âm tính bị nhiễm chéo bởi huyết thanh/huyết tương có nồng độ kháng thể cao

- Dung dịch cơ chất bị nhiễm bởi các tác nhân oxy hóa (thuốc tẩy, ion kim loại…)

10.2. Xử trí

- Tuân thủ đúng các quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm

- Kiểm tra và vệ sinh máy thường xuyên trước và sau khi làm xét nghiệm

- Tuân thủ đúng quy trình xét nghiệm

XI. HỒ SƠ LƯU

• Lưu trữ các biểu mẫu phiếu QC theo đúng quy định của khoa.

XII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

Tên tài liệu	Mã tài liệu
Quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm
Sổ tay hướng dẫn lấy mẫu bệnh phẩm
Quy trình an toàn phòng xét nghiệm
Hướng dẫn sử dụng kit real-time PCR xác định RICKETTSIA