I. MỤC ĐÍCH

Quy định thống nhất cách thức tiền xử lý các mẫu BP của xét nghiệm MTB như đờm, dịch, phân, sinh thiết, tinh dịch, mủ...

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

   Áp dụng tại Khoa xét nghiệm Vi sinh - Bệnh viện đa khoa Tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• Quyết định 26/QĐ-BYT ban hành ngày 03/01/2013 về việc ban hành tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh Y học”
• Bộ Y tế, Giáo trình thực hành Vi sinh vật, NXB Y học, 2004.

IV. TRÁCH NHIỆM

• Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
• Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
• Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

V. ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

RT – PCR	Real Time Polymerase Chain Reaction
DNA	Deoxyribose Nucleic Acid
BP	Bệnh Phẩm
IC	Internal Control
RT – PCR	Real Time Polymerase Chain Reaction
MTB	Mycobacterium tuberculosis

VI. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

6.1. Trang thiết bị

- Máy ly tâm Centrifuge 5424R (Eppendorf)

- Máy ly tâm MF 80 ( Hanil)

- Tủ lạnh 2°C - 8°C

- Tủ âm sâu (-20°C)

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Tủ an toàn sinh học Esco PCR Cabinet

- Máy vortex

- Micropipettes 10µl, 100 µl, 1000 µl

- Máy ly tâm lắng mẫu nhanh cho tuve 0,2ml

- Máy tách chiết DNA – RNA tự động SaMag 12 – Sacase Biotechnology

- Máy SaCycler – 96 Real Time PCR System - Sacase Biotechnology

- Bộ lưu điện

6.2. Dụng cụ hóa chất, vật tư tiêu hao

- SaMag Viral Nucleic Acid Extraction Kit

- Kít định lượng virus HBV Real-TM (HBV Real-TM Quant Dx): Đạt tiêu chuẩn ISO 9001:2008 & 13485:2012.

- Khay đựng bệnh phẩm

- Hộp vận chuyển bệnh phẩm  

- Tube đựng bệnh phẩm  15ml, 50ml

- Đầu  côn  có  lọc  10µl , 100 µl, 1000 µl

- Effendorf  loại 1,5 ml vô trùng

- Giấy thấm 

- Giấy xét nghiệm 

- Sổ lưu kết quả xét nghiệm 

- Bút viết kính 

- Bút bi 

- Mũ 

- Khẩu trang 

- Găng không có bột

- Găng tay xử lý dụng cụ 

- Quần áo bảo hộ 

- Dung dịch nước rửa tay 

- Cồn sát trùng tay nhanh 

- Dung dịch khử trùng 

- Khăn lau tay 

- Dụng cụ để làm lạnh và giữ ống PCR

6.3. Mẫu bệnh phẩm

- Lấy mẫu bệnh phẩm theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.

- Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu.

VII. NỘI DUNG

7.1. Chuẩn bị mẫu

Các loại mẫu BP sau đây được lấy tùy thuộc vào chẩn đoán lâm sàng:

- BN được chẩn đoán là lao phổi thì BP là đờm được lấy vào sáng sớm, BN chưa ăn và chưa làm vệ sinh răng miệng. Mẫu BP có thể là dịch hút đờm hay rửa khí quản lấy khi nội soi. Mẫu BP là dịch hút dạ dày để chẩn đoán lao phổi ở trẻ sơ sinh.

- BN được chẩn đoán là lao màng não: mẫu BP là dịch não tủy

- BN tràn dịch màng phổi: mẫu BP là dịch màng phổi hay mảnh sinh thiết màng phổi.

- BN được chẩn đoán lao xương hay lao cột sống: mẫu BP là mủ cạo từ xương lấy khi phẫu thuật hay qua dẫn lưu.

- BN được chẩn đoán lao da hay lao hạch: mẫu BP là mảnh sinh thiết

- BN được chẩn đoán là lao ruột: mẫu BP nên lấy là phân

- BN được chẩn đoán là lao tinh hoàn hay mào tinh hoàn: mẫu BP là tinh dịch

- BN được chẩn đoán là lao kê thì mẫu BP là đờm hoặc máu toàn phần.

- BN được chẩn đoán lao bàng quang hay lao thận: mẫu BP là nước tiểu 24 h ly tâm lấy cặn.

7.2. Tiến hành kỹ thuật

7.2.1. Quy trình xử lý các mẫu BP chứa đờm (rửa khí quản, dịch hút dạ dày…)

Bước 1: Đánh dấu các ống falcon tương ứng với ký hiệu mẫu BP.

Bước 2: Pha dung dịch SP4 trong ống falcon gồm 10ml dung dịch SP1 + 1 ống hóa chất 0.5g SP3.

Bước 3: Cho khoảng 3ml đờm hoặc dịch chứa đờm vào falcon chứa 5 ml dung dịch SP4, vortex cho tan đờm và để yên ở nhiệt độ phòng trong 20 phút.

Bước 4: Pha dung dịch SP5 trong ống falcaon gồm 1ml dung dịch SP2 + 9ml nước cất.

Bước 5: Thêm 5ml dung dịch SP5 vào ống đựng mẫu BP, lắc nhẹ rồi ly tâm 4500 vòng/phút trong 20 phút.

Bước 6: Loại bỏ dịch nổi và thu khoảng 0.5ml cặn, dùng để tách chiết DNA.                                     

Bước 7: Bảo quản mẫu BP ở -20°C

7.2.2 Quy trình xử lý mẫu BP là các dịch

Các dịch như dịch màng phổi, màng bụng, màng tim, dịch não tủy và nước tiểu 24 h: thu toàn bộ thể tích dịch vào ống falcon hoặc eppendorf và ly tâm lấy cặn, bảo quản mẫu BP ở -20°C.

7.2.3. Quy trình xử lý mẫu BP quyệt tăm bông

- Cho tăm bông vào Eppendorf chứa 0.5 ml TE1X, dùng tay xoay tăm bông nhiều lần vào thành ống hoặc vortex mạnh.

- Ép kiệt nước khỏi tăm bông vào thành ống eppendorf, bảo quản mẫu BP ở -20°C.

7.2.4. Quy trình xử lý mẫu BP là mủ, phân hay tinh dịch

- Pha loãng BP với TE1X thể tích tương đương thể tích mẫu, vortex thật đều

- Ly tâm lấy cặn tế bào, bảo quản mẫu BP ở -20°C.

7.2.5. Quy trình xử lý mẫu BP là mô sinh thiết

- Các mẫu sinh thiết bảo quản trong eppendorf chứa 100µl dung dịch TE1X

- Dùng chày nghiền nhỏ mảnh sinh thiết và vortex thật mạnh, bảo quản mẫu BP ở -20°C.

7.2.6. Quy trình xử lý mẫu FFPE

- Tẩy paraffin bằng xylene, sau đó rửa sạch xylene bằng acetone. Loại hoàn toàn acetone bằng cách làmbay hơi tự nhiên.

- Các mẫu mô sinh thiết bảo quản trong eppendorf chứa 100µl dung dịch TE1X xong bảo quản ở -20°C

- Dùng chày nghiền nhỏ mảnh sinh thiết và vortex thật mạnh, bảo quản mẫu BP ở -20°C.

VIII. HỒ SƠ LƯU

• Lưu trữ các biểu mẫu phiếu QC theo đúng quy định của khoa.

IX. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

Tên tài liệu	Mã tài liệu
Quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm
Sổ tay hướng dẫn lấy mẫu bệnh phẩm
Quy trình an toàn phòng xét nghiệm