I. MỤC ĐÍCH

Mô tả quy trình hướng dẫn cho cán bộ phòng nuôi cấy quy trình nuôi cấy để  phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh từ bệnh phẩm hầu họng.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

Quy trình này áp dụng cho các nhân viên phòng nuôi cấy, khoa Vi sinh, Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• Diagnostic Microbiology-4^thEdition-Washington, Philadelphia
• Bergey^’s Manual of Determinative Bacteriology-9^thEdition-William&Wilkins
• Manual of Clinical Microbiology-8^thEdition-WashingtonDC-Patrick R.Murray
• Kỹ thuật xét nghiệm Vị sinh lâm sàng (Nhà xuất bản Y học, 2006)

IV. TRÁCH NHIỆM

• Nhân viên xét nghiệm khoa vi sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh có trách nhiệm thực hiện theo đúng quy trình
• Người thực hiện: cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên nghành vi sinh, làm việc tại khoa Vi sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh

V. ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

Giải thích thuật ngữ

• Không áp dụng

Từ viết tắt

• SOP     =          Quy trình chuẩn (Standard of Procedure)
• KXN   =          Khoa Xét nghiệm
• BA      =          Thạch máu
• CA      =          Thạch sô cô la
• MBA   =          Xanh methylen kiềm

VI. NGUYÊN LÝ

Cấy trên môi trường thích hợp để tăng sinh vi khuẩn, từ đó có thể lựa chọn và phân lập được những vi sinh vật gây bệnh.

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

Thiết bị

• Tủ ấm Memmert
• Tủ ấm CO2 
• Tủ an toàn sinh học

• Kính hiển vi

Dụng cụ

• Dầu soi
• Giấy thấm

- Que cấy

- Giá đỡ

Hóa chất, thuốc thử

• Thạch máu
• Thạch sô cô la
• Thạch phân biệt để nhận dạng các chủng

• Các hoá chất để định dạng vi khuẩn
• Bộ thuốc nhuộm Gram
• Xanh methylen kiềm

VIII. NỘI DUNG

Bệnh phẩm

• Dịch ngoáy họng

• Bệnh phẩm phải có đầy đủ thông tin, ống tăm bông phải kín và không bị khô.

Kỹ thuật tiến hành

• Nhuộm Gram (sau khi tiến hành nuôi cấy nếu bệnh phẩm chỉ là một que tăm bông).
• Nếu có yêu cầu của bác sĩ là tìm vi khuẩn bạch hầu thì phết lam nhuộm với xanh Methylen kiềm.

+ Cố định lam bệnh phẩm bằng đèn cồn (không quá nóng hoặc để khô tự nhiên).

+ Phủ lam bằng MBA để trong vòng 30-60s.

+ Rửa nhẹ dưới vòi nước và để khô tự nhiên.

+ Soi dưới vật kính dầu.

• Kỹ thuật nuôi cấy:

+ Đánh số bệnh phẩm trên đĩa BA và CA (chỉ làm khi có yêu cầu cấy tìm bạch hầu hoặc não mô cầu)

+ Ấn nhẹ và quay vòng tăm bông ngoáy họng lên trên một góc mặt của đĩa BA

+ Đốt que cấy và để nguội rồi ria lên trên mặt môi trường bắt đầu từ vùng nguyên uỷ, rồi sau đó ria phân vùng

+ Cấy lại trên đĩa CA như với đĩa thạch máu

+ Để đĩa BA và CA vào tủ ấm CO2 /24h

• Đọc kết quả những ngày sau đó.

IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

• Quan sát sau 24h nuôi cấy:
• Kiểm tra đĩa BA để tìm các khuẩn lạc dung huyết b
• Kiểm tra đĩa CA và chọn các khuẩn lạc nghi ngờ giống như các khuẩn lạc khô đen nghĩ đến bạch hầu. Các khuẩn lạc xám bóng nghĩ đến não mô cầu.
• Làm một tiêu bản Gram của các khuẩn lạc trên đĩa thạch BA hoặc làm tiêu bản MBA trên đĩa CA.
• Định danh các vi khuẩn theo thường quy
• Xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn gây bệnh.
• Đánh giá tiêu bản nhuộm MBA
• Chụp ảnh tiêu bản và chọn lựa vùng để kiểm tra với vật kính dầu 100 để tìm tế bào bạch hầu và vi khuẩn có mặt như trực khuẩn  với nhuộm nhiễm sắc thể và báo cáo sơ bộ.
• Kết quả nuôi cấy:

+ Báo cáo cuối cùng “vi khuẩn chí bình thường” khi có mặt của tụ cầu coagulase âm tính và các loài Nesseria.

+ Báo cáo cuối cùng “vi khuẩn gây bệnh” khi có mặt của: Liên cầu dung huyết b, bạch hầu.

+ Trong trường hợp tụ cầu vàng, phế cầu, H.influenzae, Pseudomonas thì được báo cáo nếu sự có mặt là thuần chủng và duy nhất.

X. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

• BA, CA phải được kiểm tra hàng tuần về việc bội nhiễm bằng cách sử dụng chủng vi khuẩn chuẩn.
• Các hoá chất để định loại vi khuẩn phải được kiểm tra chất lượng hàng tuần.

XI. AN TOÀN

• Phải cẩn thận khi cầm bệnh phẩm và tiến hành thử nghiệm.
• Nếu nghi ngờ não mô cầu thì phải tiến hành các thử nghiệm ở tủ an toàn sinh học cấp II.
• Xử lý tất cả các bệnh phẩm như tác nhân gây nhiễm trùng.

XII. HỒ SƠ LƯU

• Không áp dụng

XIII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

Không áp dụng