I. MỤC ĐÍCH

Mô tả và hướng dẫn cách thực hiện xét nghiệm nhuộm soi Gram và nhận định sơ bộ hình ảnh vi khuẩn và các hình ảnh tế bào (nếu có) trực tiếp từ bệnh phẩm.

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

Áp dụng tại Khoa xét nghiệm Vi sinh - Bệnh viện đa khoa Tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• Quyết định 26/QĐ-BYT ban hành ngày 03/01/2013 về việc ban hành tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh Y học”
• Bộ Y tế, Giáo trình thực hành Vi sinh vật, NXB Y học, 2004.

IV. TRÁCH NHIỆM

• Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
• Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
• Cán bộ QLCL, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình

V. ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

HD	Hướng dẫn
QC	Quality control
QLCL	Quản lý chất lượng
QTKT	Quy trình kỹ thuật
VK	Vi khuẩn
VS	Vi sinh

VI. NGUYÊN LÝ

Đánh giá hình thể, kích thước, tính chất bắt màu, cách sắp xếp của vi khuẩn và các hình ảnh tế bào (nếu có) bằng kỹ thuật nhuộm và soi dưới kính hiển vi quang học

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

7.1. Trang thiết bị

• Máy ly tâm (cần cho một số loại bệnh phẩm)
• Tủ an toàn sinh học cấp 2
• Kính hiển vi quang học
• Dụng cụ sấy lam (nếu có)

7.2. Dụng cụ hóa chất, vật tư tiêu hao

Lọ lấy bệnh phẩm

Que cấy

Lam kính

Dầu soi kính

Cồn 90°lau kính

Nước muối sinh lý

Thuốc nhuộm đỏ fuchsin

Thuốc nhuộm tím gentian

Cồn tẩy 95%

Lugol

Thuốc nhuộm xanh methylen

Bông

Cồn 90°(vệ sinh dụng cụ)

Đèn cồn

Panh

Khay đựng bệnh phẩm

Hộp vận chuyển bệnh phẩm

Mũ

Khẩu trang

Găng tay

Găng tay xử lý dụng cụ

Quần áo bảo hộ

Acid ngâm lam

Ống nghiệm thủy tinh

Bút viết kính

Bút bi

Bật lửa

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Cồn sát trùng tay nhanh

Dung dịch nước rửa tay

Khăn lau tay

Giấy trả kết quả xét nghiệm

7.3. Mẫu bệnh phẩm

Tất cả các mẫu bệnh phẩm có chỉ định vi khuẩn nhuộm soi.

VIII. NỘI DUNG

8.1. Chuẩn bị

• Khởi động tủ an toàn sinh học ít nhất 15 phút trước khi thực hiện
• Sắp xếp các dụng cụ cần thiết vào tủ an toàn sinh học
• Chọn lam kính sạch, không xước. Hơ lam kính qua ngọn lửa đèn cồn để hủy chất dầu còn dính trên lam kính, để nguội lam tự nhiên.
• Đánh dấu tiêu bản bằng cách dùng bút chì đen HB ghi mã số bệnh phẩm lên đầu mờ lam kính.

8.2. Dàn tiêu bản

• Thực hiện trong tủ an toàn sinh học
• Bệnh phẩm dàn đều đặn liên tục tạo độ mịn dày vừa phải hình ô van kích thước dài 2 cm rộng 1cm.
• Ngâm que phết sau khi dàn vào dung dịch sát khuẩn phenol 5% hoặc Jave 0,5%.

8.3. Làm khô tiêu bản

• Đặt tiêu bản lên mâm kính và đê tiêu bản khô tự nhiên hoàn toàn ở nhiệt độ phòng (18-25°C).

Lưu ý: Không làm khô tiêu bản bằng đèn cồn hoặc ánh nắng mặt trời.

8.4. Cố định tiêu bản

• Thực hiện bên ngoài tủ an toàn sinh học
• Hơ nóng tiêu bản qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 3-4 làn, mỗi lần 3 giây.

Lưu ý: Không cố định khi tiêu bản chưa khô hoàn toàn.

8.5. Nhuộm màu

• Đặt tiêu bản lên giá nhuộm
• Phủ đầy dung dịch Tím gentians lên mặt phết tiêu bản đã được cố định.
• Để trong 1 đến 2 phút.
• Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.
• Phủ dung dịch lugol 1 phút.
• Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.
• Tẩy màu bằng cồn 90◦ đến khi bạc màu. 10 đến 30s.
• Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ (lưu ý: Không xối vòi nước thẳng vào vết dàn)
• Phủ thuốc nhuộm Fuchsin kiềm 30 giây.
• Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.

IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

9.1.  Đánh giá hình ảnh vi khuẩn trên tiêu bản nhuộm Gram

• Soi tiêu bản bằng việc sử dụng kính hiển vi quang học vật kính dầu 100X theo hướng dẫn sử dụng kính hiển vi vật kính dầu mã hiệu VS.HD.03

+  VK Gram dương : vi khuẩn bắt màu tím sẫm của gentians

+  VK Gram âm : vi khuẩn bắt màu đỏ của fuchsin

9.2.  Đánh giá hình ảnh tế bào trên tiêu bản nhuộm đơn (nếu có)

X. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

10.1. Kích cỡ mẫu bệnh phẩm trên lam kính

• Hình ovan nằm ở giữa lam
• Chiều rộng 1 cm, chiều dài 2 cm.

10.2. Độ mịn

• Bề mặt tiêu bản liên tục, đều đặn, không bị rỗng, bong.
• Soi kính: Các vi trường liên tục không có nhiều vi trường rỗng độ sáng đều.

10.3. Độ sạch

• Soi không thấy các cặn bẩn, cặn Fuchsin, tinh thể....
• Nếu thấy các cặn bẩn có thể do thuốc nhuộm để lâu.

XI. AN TOÀN

Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm theo quy trình về an toàn xét nghiệm mã hiệu STAT

XI. LƯU Ý

• Gram dương giả: Tẩy cồn chưa đủ thời gian
• Gram âm giả:

+  Tuổi của mẫu cấy vi khuẩn ảnh hưởng lên tính chất nhuộm Gram ở

các mẫu cấy vi khuẩn để thời gian quá lâu.

+  Tẩy cồn quá lâu và tráng không kỹ.

• Nhuộm lại tiêu bản khi nghi ngờ kết quả không chính xác.

XII. HỒ SƠ LƯU

• Lưu trữ các biểu mẫu phiếu QC theo đúng quy định của khoa.

XIII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

Tên tài liệu	Mã tài liệu
Sổ tay lấy mẫu bệnh phẩm Khoa Vi Sinh	VS.STLM
Hướng dẫn sử dụng kính hiển vi
Hướng dẫn sử dụng tủ an toàn sinh học
Quy trình trả kết quả xét nghiệm Khoa Vi Sinh