I. NGUYÊN LÝ

- Đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm là một bệnh rối loạn tế bào gốc tạo máu. Đột biến xảy ra ở tế bào gốc tạo máu làm mất gen GPI-A, gen này tổng hợp protein gắn màng glycosyl-phosphatidylinositol (GPI). Do mất hoặc thiếu hụt các GPI nên các protein gắn màng (như CD55, CD59) gắn ít hoặc không gắn được lên màng tế bào hồng cầu do vậy không bảo vệ được tế bào trước sự tấn công của bổ thể, dẫn tới các tế bào hồng cầu dễ bị hoạt hóa bởi bổ thể và gây vỡ hồng cầu.

- Trên phân tích tế bào dòng chảy, tế bào máu ngoại vi ủ với anti CD45 sau ly giải hồng cầu sẽ phân bổ thành 3 vùng quần thể rõ rệt: vùng bạch cầu hạt, vùng mono, và vùng lympho.

- Dựa trên các đặc tính này, kỹ thuật flow cytometry sử dụng các kháng thể đặc hiệu gắn huỳnh quang để phát hiện sự có mặt, thiếu hụt, hoặc mất các thụ thể CD55 và/hoặc CD59 trên các quần thể tế bào bạch cầu. Từ đó góp phần chẩn đoán xác định bệnh đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm.

II. CHỈ ĐỊNH

Suy tủy xương, nghĩ đến bệnh đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm.

III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

IV. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

- Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;

- Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.

2. Phương tiện, hóa chất.

2.1. Phương tiện

- Máy phân tích tế bào dòng chảy (máy flow cytometer);

- Máy ly tâm;

- Máy lắc trộn;

- Pipet man và đầu pipet loại 250 µl và 1000 µl;

- Ống nghiệm flow cytometry (chuyên dụng cho máy phân tích tế bào dòng chảy).

- Găng tay.

2.2. Hóa chất

- Anti CD45-PC5;

- Anti CD55-PE;

- Anti CD59-FITC;

- Dung dịch ly giải hồng cầu;

- Dung dịch sheath chạy máy flow;

- Dung dịch đệm PBS.

- Nước cất, hóa chất khử trùng Natri hypoClorite.

3. Bệnh phẩm

- Là mẫu máu ngoại vi chống đông bằng EDTA. Mẫu được lấy từ các người bệnh nghi ngờ đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm và người bệnh có hội chứng rối loạn sinh tủy.

4. Người bệnh

Thông báo trước khi thực hiện xét nghiệm.

5. Phiếu xét nghiệm

Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về người bệnh: họ tên, tuổi, gường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán…

V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1. Lấy bệnh phẩm

- 2ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA;

- Mẫu cần được ủ kháng thể ngay trong vòng 6 giờ sau lấy mẫu.

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1. Chuẩn bị mẫu

- Lấy 100 µl máu cho vào 1 ống nghiệm flow cytometry.

- Ly giải hồng cầu bằng 1 ml dung dịch ly giải hồng cầu, ủ nhiệt độ phòng trong 10 phút.

- Ly tâm rửa huyền dịch tế bào sau ly giải hồng cầu 2 lần, mỗi lần thực hiện như sau: thêm 3 ml dung dịch PBS vào ống flow cytometry, trộn lắc đều và ly tâm 2000 vòng/phút trong 3 phút. Đổ bỏ dịch nổi, để lại cặn tế bào và lượng dịch còn lại (khoảng 100 µl). Trộn đều cặn và lượng dịch còn lại.

2.2. Ủ kháng thể

- Cho kháng thể anti CD45-PC5, anti CD55-PE, anti CD59-FITC (mỗi loại 20 ml) vào ống flow cytometry chứa cặn tế bào đã phá hồng cầu ở bước trên. Trộn đều và ủ nhiệt độ phòng 20 phút, tránh ánh sáng.

- Rửa bỏ kháng thể thừa: sau ủ, thêm 3 ml dung dịch PBS vào ống flow cytometry, trộn đều và ly tâm 2000 vòng/phút trong 3 phút. Đổ bỏ dịch nổi, để lại cặn tế bào.

- Thêm 1 ml PBS vào ống cặn tế bào, trộn đều. Lúc này ống đã sẵn sàng cho phân tích.

2.3. Phân tích CD55, CD59 bạch cầu trên máy flow cytometry

- Đưa ống flow cytometry vào vị trí đọc trên máy.

- Mở chương trình phân tích CD55, CD59 bạch cầu đã lập sẵn trên máy. Nhập vị trí ống phân tích và chạy chương trình phần mềm phân tích.

VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Chủ yếu quan sát phân tích trên quần thể bạch cầu mono và bạch cầu hạt, vùng bạch cầu lympho không thấy rõ sự biến đổi.

- Bình thường: Không có thiếu hụt CD55 và/hoặc CD59 ở các quần thể bạch cầu hạt và mono (CD55/CD59 bạch cầu dương tính >95%).

- Nếu mức độ dương tính CD55 và/hoặc CD59 của quần thể bạch cầu hạt và bạch cầu mono nằm trong giới hạn bình thường (dương tính >95%): Không có thiếu hụt hoặc mất CD55, CD59 bạch cầu.

- Nếu mức độ dương tính CD55 và/hoặc CD59 của quần thể bạch cầu hạt và bạch cầu mono thấp ≤ 95% (dương tính ≤ 95%): Có thiếu hụt và mất CD55 và/hoặc CD59 bạch cầu.

àĐây là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán bệnh Đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm.

VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Sai sót mẫu bệnh phẩm: Tên bệnh nhân trên giấy xét nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.

àXử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu bị đông hoặc đã để quá lâu thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.

- Các tế bào bạch cầu nằm không đúng vùng tế bào trong cửa sổ chương trình chạy. Nguyên nhân có thể do thực hiện không đúng, lượng kháng thể ủ không đủ, thực hiện không đủ các bước của quy trình, ủ không đủ thời gian, hút pipet không tốt, tắc kim hút trên máy…

àXử trí: Làm lại xét nghiệm và tuân thủ theo đúng quy trình. Kiểm tra máy trước khi phân tích, phải rửa máy, đuổi bọt khí và thông kim hút (nếu cần) theo hướng dẫn đi theo máy.